基因重组技术生产胰岛素.pptxVIP

;第七章 克隆基因的表达;外源基因在宿主细胞中表达;原核生物基因表达系统;用原核生物作宿主;识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。;3. 转录和翻译偶联、连续进行。;4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统;1. 外源基因不能带有内含子;三、原核生物基因表达的调控;是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 ;2. 核糖体结合位点（ RBS）;3. 转录终止子;四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位;;周质（periplasm）;　由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。;（1）一致顺序; （2）-35区与-10区之间的距离;（1）SD序列;5’-UAAGGAGG-3’ ;AUG左侧的三个碱基也有影响 ;3. 启动子与外源基因之间的距离; 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。;转录水平的优化;2. 翻译水平的优化;（2）翻译的终止 ① 三个终止密码子，防止核糖体跳跃 ② 终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。;（1）表达分泌蛋白 ;① 使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ② 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③ T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。;（1）强启动子提高转录效率； （2）使用高拷贝表达载体。 ;（1）培养基 （2）环境因素 （3）诱导时间和剂量 ;1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。;4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。;1. 胰岛素的结构及其生物合成;1. 胰岛素的结构及其生物合成;2. 人胰岛素的生产方法;（2）化学合成法制人胰岛素;（3）化学转型法制人胰岛素;2. 人胰岛素的生产方法;2. 人胰岛素的生产方法; 上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外 胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。;3. 重组人胰岛素的大肠??菌工程菌的构建;表达产物的后处理路线：;生产技术的评价：;（2）人胰岛素原表达法;（2）人胰岛素原表达法;　　二硫键的正确配对率相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 　　目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。;（3）A链和B链同时表达法;（4）分泌型重组人胰岛素表达法; 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略，是将胰岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接，b-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。;第二节 外源基因在真核细胞中的表达;一、真核生物表达的优越性和必要性;3、某些真核细胞可将基因表达产物分泌到细胞培养液中，简化了纯化工艺，降低了生产成本。;（一） 外源基因在酵母中表达;（一）外源基因在酵母中表达;1. 酵母菌表达外源基因的优势;酵　母;将目的基因克隆至载体;HIV-1抗原;4. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌;5. 利用重组酵母生产乙肝疫苗;（1）乙型肝炎病毒的结构;（2）乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因; 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。;（4）产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母; 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%~2%。进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S抗原缺乏响应的人群的免疫反应。;（5）产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母;　　重组菌经甲醇诱导表达HBsAg，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的2~3%，在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克 22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。;（二）植物细胞表达系统;2. 在植物品种改良中的应用;（3）抗除草剂的转基因植物;（5）提高粮食中必需氨基酸的含量;