免疫印迹 （医学课件）.ppt

封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂应该封闭膜上所有未结合位点来降低抗体的非特异性结合。 不替换膜上的靶蛋白 不结合靶蛋白的抗原表位 不与抗体或检测试剂有交叉反应 膜于封闭液中室温轻摇孵育1-4h，也可4℃过夜。 常用的封闭剂： 脱脂奶粉（5％，TBST配制） BSA（1％） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 结合一抗、二抗 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 抗体选择 一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象（例如变性构象或天然构象）。并非所有的单克隆抗体都适合作为探针用于WETERN-BLOT，因为这一实验中靶蛋白是彻底变性的。 多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物，通常对其特异性、亲和力以及浓度都一无所知。因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果。 设置对照： 1.不与靶蛋白反应的抗体（即免疫前血清或非相关单克隆抗体） 2. 样品对照，即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品 选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物 为佳。 二、蛋白样品的定量 Western blot作为一项半定量实验技术，电泳前，必须尽量使各组之间总蛋白量基本一致; 蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳方法的分辨力。 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。 Bradford法 其原理为：蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 二、蛋白样品的定量 Lowry法 其原理为：蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽链伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林酚试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。 二、蛋白样品的定量 BCA法 是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。其原理为：蛋白质分子中的肽链在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。 二、蛋白样品的定量 BCA法蛋白浓度测定 试剂：BCA工作液 ，双蒸水，蛋白标准液（ 将2mg/ml蛋白溶液稀释至2mg/ml,1mg/ml,0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml。） 管号 0 1 2 3 4 5 蛋白标准液 100 50 25 12.5 6. 25 3.125 ddH2O 0 50 75 87.5 93.5 96.8 样品 10 10 10 10 10 10 BCA(ML) 2 2 2 2 2 2 二、蛋白样品的定量 Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、BCA法的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用浓度去垢剂的影响。 与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度最高（可低至 0.5μg/ml）。 二、蛋白样品的定量 二、蛋白样品的定量 三种方法对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，并且无可比性。 Bradford法 BCA法 试管法 100-1500μg/ml 20-2000μg/ml 微孔法 1-25μg/ml 0.5-10μg/ml 三、蛋白样品的变性 2×SDS上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。 按1: