人体骨髓基质干细胞冷冻干燥的探索性实验 .docxVIP

工程建筑学相关资料ENGINEERING ARCHITECTURE RELATED INFORMATION 工程建筑学相关资料 ENGINEERING ARCHITECTURE RELATED INFORMATION PAGE PAGE 1 人体骨髓基质干细胞冷冻干燥的探索性实验  摘要：人体骨髓基质干细胞已成为组织工程、细胞移植和基因治疗等领域的重要研究对象，目前对它已有低温保存的研究，而通过冷冻干燥的方法对其进行保存国内外未见报导。实验尝试用冻干的方法来保存骨髓基质干细胞。文中选取海藻糖、ＰＶＰ、ＨＥＳ等作保护剂，应用差示扫描量热仪(ＤＳＣ)测量其结晶温度和玻璃化转变温度;随后对加入保护剂的细胞溶液进行冻干实验，并应用流式细胞仪对冻干样品复水后的细胞活性进行了测定，其中30%ＰＶＰ+20%海藻糖对细胞的保护效果较好，细胞成活率达到16.40%。 关键词：热工学 冷冻干燥 人体骨髓基质干细胞 冻干保护剂 　　1　前言　　骨髓中含有两类组织成份:造血干细胞及其分化的子代细胞，和结缔组织(被称为基质)。在基质中除了存在着无成骨性的脂质细胞、网状细胞、内皮细胞和成纤维细胞外，还有一种独立的细胞系———基质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ)。它是一种成纤维细胞样的梭型贴壁细胞，与造血干细胞一样具有多分化潜能，因而日益受到人们的关注。在特定的条件下，骨髓基质干细胞可以分化形成成骨细胞(ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ)、软骨细胞(ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ)、成肌细胞(ｍｙｏｂｌａｓｔｓ)和神经细胞(ｎｅｕｒｏｃｙｔｅｓ)[1.2]。ＭＳＣｓ易于获得、特性稳定，是组织工程中理想的种子细胞，有很好的应用前景。它的广泛应用使其保存问题备受关注。目前，多采用-196℃的深低温保存[3]，但液氮费和管理费用相当昂贵，所以有必要探索新的保存方法。　　冷冻干燥技术是在低温真空下干燥制品，干燥后体积、形状基本不变，物质呈海绵状，无干缩;复水时能够迅速还原成原来的性状;能够除去物质中90%以上的水分，制品的保存期长，而且在保存过程中可以置于室温下保存;且便于长途运输。由于以上这些无可比拟的优越性，冻干保存倍受人们的关注，但由于活体细胞结构的复杂性，对其冻干保存一直是尚未解决的难题，仍然处于探索阶段[4～6]。对人体骨髓基质干细胞进行冻干实验研究，选取了几种保护剂，并应用差示扫描量热仪(ＤＳＣ)对加入不同保护剂的细胞悬液的结晶温度以及其最大浓缩玻璃化转变温度进行了测定;随后对样品进行冷冻干燥实验;并应用流式细胞仪对冻干结果进行了活性检测。　　2　保护剂的选取与配制　　2.1　保护剂的选取　　在许多生物制品的冷冻干燥过程中，常常采用低聚糖，尤其是二糖作为保护剂。这是因为二糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。在生物制品的冷冻干燥配方中，海藻糖较常用，它具有较好的保护能力，对于海藻糖的保护机理，Ｃｒｏｗｅ等认为[7]:(1)海藻糖的水合分子半径要比其它糖(如蔗糖、葡糖糖)大2.5倍，这使得它的水合分子独立于被保护的蛋白质的水合分子之外，从而起到稳定蛋白质、保护细胞膜和细胞内重要的膜结构的作用;(2)海藻糖能够降低干态膜脂的熔点，从而避免了在复水过程中膜的相变;(3)海藻糖能够形成稳定的二水化合物。在有少量水分存在时，这些二水化合物能防止水分与未水合的海藻糖结合，从而保持较高的玻璃化温度。这样冻干后的样品即便在较为潮湿的环境中也可保存较长时间。　　由于多元醇与糖的官能团都是羟基，通常认为多元醇在生物制品的冷冻干燥过程能起到保护作用。另外，聚合物能够提高生物制品混合溶液的玻璃化转变温度等有利因素，因而在有些生物制品的配方中常常含有各种聚合物类保护剂。所以本文选用海藻糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮(ＰＶＰ)、羟乙基淀粉(ＨＥＳ)和牛血清(ＦＢＳ)等作为保护剂。　　2.2　保护剂的配制　　实验中所采用的人体骨髓基质干细胞由上海市组织工程研究与开发中心提供。　　选用的几种实验材料如下:　　聚乙烯吡咯烷酮Ｋ30(ＰＶＰＫ30，上海);甘露醇(上海);6%羟乙基淀粉注射液(ＨＥＳ，北京);海藻糖(上海);小牛血清(ＦｅｔａｌＢｏｒｉｎｅＳｅｒｕｍ，美国)。　　首先配制不同浓度的组分:ＰＶＰ(30%，40%，50%Ｗ/Ｗ);海藻糖(20%Ｗ/Ｗ);甘露醇(10%Ｗ/Ｗ)，然后将各组分按照一定的配比滴注到细胞悬液中，同时振荡摇匀，配制成的细胞溶液具体如下表(Ａ为单纯的细胞悬液):　　3　应用ＤＳＣ测量保护剂参数　　为了防止在冻干过程中受损伤，我们一般希望将样品冷却到玻璃化转变温度(Ｔｇ)之下，并在此温度下进行干燥。还有另外一个重要参数，即最大冻结浓缩玻璃化转变温度(Ｔｇ’)，它