ellman试剂法测定自由巯基和二硫键.docx

标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N] 标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N] ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键 ELLMAN试剂测定自由巯基 试验基于的原理： 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNBTNB2- 根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。 ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有： EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。 在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。 DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在 pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。 摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案 主要材料： 1.材料 PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/ml G-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml 10k超滤膜PALL 2.试剂 SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。20ug/小瓶。加入20ul50mMNH4HCO3，pH7.8溶解，配成1ug/ul的酶液。 1MDTT刘春凤提供 TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114 乙腈：FisherScientificLot#055848 StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ) PEG肽段反相分离流动相 A液：0.1%TFA/H2O B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O 3.仪器 质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号KC2007-011) Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039） BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005） 恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003） 反相柱：SymmetryC185um300à4.6*150mm，LotNO 高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector） 试验过程： 一、缓冲液替换 PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mMNH4HCO3，pH7.8。使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。 PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。 二、酶切处理 1）取37ulG-CSF,共400ug，加入125.5ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 取63.ulPEG-G-CSF,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。 2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10