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实验 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定;;1.原理;在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活,为了获得较好的分离提取效果,在工作中特别注意以下几点:
取用新鲜的材料,提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。选择来源丰富,酶含量高的材料。
用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大(20℃,每升可溶760克),并且对许多酶没有很大的影响,因此它是最常用的盐。
在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步骤才有效。;酶活力的分析:通常是以对-硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。
酶活力定义为:在37℃下,以2 mmol/L pNPP为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 ?mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenol reagent)显色法 ;操作方法
3.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取
每组称取20 g牡蛎(蒸馏水洗净),加入50 mL预先冷却的0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5,含0.1 mol/L NaCl),(两组一起)于高速组织捣粹机匀浆1 min,于冰箱4℃放置1 h进行抽提。
室温离心,3000 r/m 20 min,收集离心上清液,(两组分开)并量体积。(留2 mL上清液,待测酶的比活力。)
在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度(100 mL加入20.9 g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置1 h。
室温离心,3000 r/m 20 min,收集离心上清液,并量体积。(留2 mL上清液,对0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液pH 7.5含0.1 mol/L NaCl 透析平衡,待测酶的比活力。)
;(5) 0.35饱和硫酸铵上清液,加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度(100 mL加入23.8 g)。缓慢加入,不断搅拌溶解,置冰箱静置2 h。
(6)室温离心,4000 r/m 20 min,收集沉淀物。
(7) 得到沉淀物,溶于5 mL含0.1 mol/L NaCl 的0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。装入透???袋,对0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡,至无SO42-被检测出为止(可用一定浓度BaCl2溶液检验)。
(8) 取出酶溶液,冷冻高速离心(0℃ 25000 r/m 30 min)。
(9) 离心上清液即为粗酶制剂,检测酶的比活力。装入棕色瓶于4℃冰箱保存。;20 g牡蛎;3.2 比活力测定
3.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作(不做):
取15支试管编号,0号一支,1-7号各二支,按下列表格操作。;管 号;管号;3.2.3蛋白浓度的测定
本实验采用紫外吸收法(OD280)测定蛋白浓度。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释,稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。(一般稀释5-10倍)。;3.3 结果处理;将测定的数据或计算结果用下表记录。(本实验不做) ;4.注意事项
(1)在加硫酸铵时,需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢,尽量防止泡沫的形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。
(2)测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水浴锅中预热及反应。
(3)紫外分光光度测定需用石英杯。
(4)稀释倍数
(5)移液器的使用
;;在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活,为了获得较好的分离提取效果,在工作中特别注意以下几点:
取用新鲜的材料,提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。选择来源丰富,酶含量高的材料。
用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大(20℃,每升可溶760克),并且对许多酶没有很大的影响,因此它是最常用的盐。
在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步骤才有效。;酶活力的分析:通常是以对-硝基苯磷酸二钠(pNPP)为底物,在pH10.1的碳酸盐缓冲液(含2 mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚(pNP)的量。产物pNP在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。
酶活力定义为:在37℃下
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