细胞培养技术实用篇.ppt

培养液PH值（颜色变化） 变黄，表示PH值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。 变红或紫红色，表示PH值上升，细胞生长停滞、死亡。 一般生长稳定的细胞需要2-3天换液1次，生长慢的细胞需要3-4天换液一次。 细胞换液 原代细胞经24小时培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液可刺激细胞生长。 通常每周两次，每次换半量或1/5-1/3量。原代细胞第1次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。 细胞株（系）：条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。 细胞生长状况 常规应特别注意细胞的生长增殖情况。 原代细胞：经历一个适应或潜伏期。 细胞系：多为24小时以内。 细胞长满瓶底80%时应及时传代。 细胞形态变化 生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。 生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。 微生物污染 培养液颜色与透明度： 培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。 支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。 细胞培养污染的概念 不仅仅指微生物，包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物，因此一般包括微生物(真菌、细菌、病毒和支原体)、化学物质(影响细胞生存、非细胞所需的化学成份)及细胞(非同一种的其它细胞)。其中以微生物污染最多见。另外随着细胞种类增多．不同种细胞交叉污染也时有发生、从而造成细胞不纯。 污染的途径 空气：空气是微生物传播的最主要途径。 净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行 工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强 减少空气流动是防止污染的重要环节。 污染的途径 器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底 洗刷不干净，污物残留及培养用液等灭菌不彻底 CO2温箱．由于温箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱内是开放式培养．如不定期消毒,可形成污染. 污染的途径 操作 无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具或封瓶时不严 培养两种以上细胞时，操作不规范、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。 污染的途径 血清：有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。 组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。 污染对细胞的影响 支原体和病毒对细胞的形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的 霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞。 化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性较小、如能及时排出，细胞仍可存活．但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化 细菌的污染和检测 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌、白色葡萄球菌， 以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改 变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 细菌污染 细菌污染的检测 肉眼直接观察法 培养检查法 显微镜观察法 PCR检测 真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、 黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列，培养液一般不发生浑浊。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡 真菌污染 支原体污染和检测 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2um，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体 支原体污染的检测 相差显微镜观察法 Hayflick 培养基直接培养法 DNA荧光染色法（Hoechst 33258） PCR方法（即用型细胞培养中支原体检测PCR试剂盒） 病毒的污染和检测 细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 PCR技术 污染的预防 防止污染，预防是关键，预防措施应贯穿于整个细胞培养的始终。 器皿准备—开始操作前—操作过程中—其他细节