血红蛋白的提取和分离2.pptxVIP

一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 ;㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）;3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。;用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快;㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：;相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个;1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。;3、缓冲溶液的配制;（三） 电泳：;; 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳;SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。;使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 ;;样品处理;血液组成成分;思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;1. 红 细 胞的洗 涤;(2)血红蛋白的释放：;2.释放血红蛋白;(3)分离血红蛋白溶液：;甲苯层（无色透明）;4.透析血红蛋白;透析过程动画演示;课题3 血红蛋白的提取与分离;（二）凝胶色谱操作;（2）凝胶色谱柱的装填; ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分???物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ;2、凝胶色谱柱的装填;装配好的凝胶柱;3、样品加入与洗脱---调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质;注意：正确的加样操作是（1）不要触及并破坏凝胶面。（2）贴壁加样。（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。;收集得到的纯化后的蛋白;思考下面的问题：;（三）.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳;课题3 血红蛋白的提取与分离;三、实验结果分析与评价; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。;三、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;样品处理;思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;1. 红 细 胞的洗 涤;甲苯层（无色透明）; ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ;装配好的凝胶柱;注意：正确的加样操作是（1）不要触及并破坏凝胶面。（2）贴壁加样。（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。;（三）.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳