血红蛋白提取和分离.pptxVIP

课题3 血红蛋白的提取和分离;; 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。;一、基础知识:;一、基础知识--蛋白质提取和分离原理 ;（1）原理： （2）材料;（3）分离过程 ;(一)凝胶色谱法; 1、什么是凝胶？;1 、什么是缓冲液？;由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等;1 、什么是电泳？;2．凝胶电泳法：;影响蛋白质分子运动速度的因素; 在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 ;电泳检测结果;二、实验操作;（一）样品处理;样品处理;血液组成成分;1.洗 涤 红 细 胞;采集得到鸡血;初次离心后的结果;3次洗涤后的结果;2.释放血红蛋白;(2)血红蛋白的释放：;磁力搅拌器;3.分离血红蛋白;(3)分离血红蛋白溶液：;甲苯层（无色透明）;4.透析血红蛋白;利用透析袋透析;透析过程;纯化－－凝胶色谱操作;（二）凝胶色谱操作;装配好的凝胶柱;返回;材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液 装填:;（2）凝胶色谱柱的装填; ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 ;3.样品加入与洗脱;3.样品的加入和洗脱;3.样品加入与洗脱;收集得到的纯化后的血红蛋白;注意事项; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。; 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，??着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。;知识总结; 教学反馈 ;3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向 4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白;5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠;7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物;1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质;2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较;3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固;5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是： 有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀;