血红蛋白的凝胶过滤.pptxVIP

血红蛋白的凝胶过滤;凝胶层析技术及原理;葡聚糖;;凝胶层析(Gel chromatography):? 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav （被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。 Kav 值的大小与凝胶床的总体积（ Vt ）、外水体积（ Vo ）及分离物本身的洗脱体积（ Ve ）有关，即： Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) ; 在限定的层析条件下， Vt 和 Vo 都是恒定值，而 Ve 值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大， Kav 值小；反之，则 Kav 值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开;常用的色谱分离方法;凝胶过滤技术特点;凝胶层析的应用;凝胶层析应用;;3.脱盐及去除小分子杂质 利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。 ;;5.蛋白质的复性 为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。 ;为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。 ;影响分离效果的因素;影响凝胶过滤的因素;本实验的原理;实验主要步骤;装柱注意事项;操作步骤1;操作步骤2;步骤3;;;葡聚糖;;凝胶层析应用;5.蛋白质的复性 为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。 ;装柱注意事项;操作步骤2