血红蛋白的提取(好.pptxVIP

血红蛋白的提取和分离;蛋白质分离的原理：;阅读P64回答：;（一） 凝胶色谱法;3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程; （二）缓冲溶液; （三） 电泳：;阅读P66回答;类型:;电泳检测结果;;1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是 A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较;3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 ; 二、实验操作;血红蛋白; 用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;(1)红细胞的洗涤:;(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。;(4)透 析：;2.凝胶色谱操作:;（2）凝胶色谱柱的装填;③凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ; ;（3）样品加入与洗脱;注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。;③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ;思考下面的问题：;（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）;1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、???心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。;2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。;作业;作业; 教学反馈 ;5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物;8、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是 A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 9、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是： 有机溶剂-----脂类物质-----血红蛋白溶液------红细胞破碎物沉淀;（一） 凝胶色谱法;3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程;阅读P66回答;思考下面的问题：;1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。;5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血