某科研项目拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析.docxVIP

某科研项目拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1. 技术路线 备注：蓝色背景填充部分为前期已完成工作。 2. 研究方法 2.1 X、Y在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性 回顾性收集肠癌临床标本500例，取手术切除的肠癌组织、匹配的肝脏转移灶手术和穿刺标本，新鲜组织液氮保存标本200例，石蜡块300例，全部病例均通过临床、影像学、病理诊断，术前未进行辅助治疗，来自某某医院2008-2013年临床收治病例，随访资料齐全。 免疫组化检测组织切片中X、Y蛋白的表达及定位，分别设立阴性对照、肿瘤对照、肝转移对照。 SPSS16.0统计软件对X、Y表达及定位与临床标本进行病理关联性分析和预后统计分析，了解X、Y表达情况与相关临床资料之间的关系，单因素生存分析对临床各项指标与结肠癌生存期进行相关性分析，建立Cox比例风险回归模型，综合探讨临床各因素和X、Y表达与结肠癌肝转移、转移灶形成及预后的相关性。 2.2 体外、体内水平研究X、Y基因在肠癌肝转移中的调节功能 制备X-shRNA慢病毒，建立X稳定沉默的细胞株，以无义序列作为阴性对照，利用MTT实验观察X沉默后细胞的生长曲线；克隆形成实验检测X沉默后细胞的克隆形成能力；流式细胞术结合PI单染、Annexin-V双染检测细胞周期和凋亡情况；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。与此同时，制备过表达X的慢病毒载体。 在稳定沉默X的结肠癌细胞中，导入过表达Y的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察X沉默且Y过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。同样地，在稳定沉默Y的结肠癌细胞中，导入过表达X的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察Y沉默X过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞运动能力的变化。 制备结肠裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，建立生长曲线，统计分析Y和X对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响，明确Y和X在结肠癌恶性增殖的作用。实验分组：空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。 建立结肠癌肝转移动物模型，观察肝脏中的转移灶，统计分析Y和X对结肠癌肝转移能力的影响，明确Y和X在结肠癌肝转移过程中的作用。实验分组：空白对照、Y沉默组、X沉默组、X沉默组+Y过表达组、Y沉默组+X过表达组。 处死裸鼠取得的肿瘤组织，利用qRT-PCR和免疫组化方法检测Y/X以及下游半乳糖苷酶的mRNA和蛋白的表达；部分肿瘤组织制备成冰冻切片，利用FITC和TRITC双标记免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜观察X与Y的共定位情况。 2.3. X-Y轴调节结肠癌肝转移的分子机制研究 通过基因芯片Microarray分析X过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确X消减后表达发生改变的下游调控分子，芯片结果中有显著差异的潜在作用分子，设计引物，通过qRT-PCR进行二次表达验证。 X基因过表达/沉默后发生显著表达差异的基因，利用Bayesian Network、Genes2Networks、Go-anaslysis软件进行signaling network 重建。解析X调控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建X为核心的信号分子网络。 根据X基因沉默后影响的信号通路结果（半乳糖基转移酶及其上游调节信号通路），利用信号通路抑制剂处理X稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细胞，检测不同分子信号对X表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对X在结肠癌中的功能表型的影响。 采用信号通路高通量检测蛋白芯片，根据以上实验分析的通路情况，订购相应通路的Pathway Array试剂盒，按试剂盒操作，依据封闭、加入细胞裂解液、洗脱、加入抗体混合液、再次洗脱，加入辣根过氧化物酶HRP并洗脱、信号检测的步骤，检测X基因表达变化后的特定通路关键蛋白的变化。 分别构建X、Y的真核表达载体，共转293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）验证XY的相互结合作用。 应用生物信息学技术模拟X与Y的结合位点。在结合位点制备不同氨基酸的突变体。采用RNAi方法敲减互作蛋白表达，接着转入互作蛋白的突变体，检测细胞功能表型变化。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证X与Y之间的结合位点特异性。 EMSA实验验证X与Y之间的相互作用关系，参考蛋白相互作用实验，设计突变载体，再验证其结合特异性，由此揭示X作为Y调节蛋白其对下游RNA进行调控的精细机制。 3. 可行性分析 研究目标切实可行：我们前期的工作已明确证实：Y可以调节结肠癌的恶性增殖，并且进行了大量的预实验，可支持本课题主要科学假设。本项目是对前期研究工作的进一步补充和完善，具有较好的可行性。 技术平台与硬件设施完善：课题组成员长期从事