单抗制备小鼠免疫SOP.pdf

单抗制备免疫 一、材料准备： 弗式完全佐剂（ complete Freunds adjuvant，CFA ） 弗氏不完全佐剂（ incomplete Freunds adjuvant，IFA ） 实验动物：小鼠（ Balb/c）雌性， 8 周以上 ,体重 20g 以上 每种抗原蛋白免疫小鼠 4 只 靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水 抗原要求 ：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（ PBS 或生理盐水），纯 度大于 80%，浓度 1mg/ml 以上，总量大于 2mg。抗原尽量是可溶性 抗原，溶液为 PBS，如必需加入刺激物质， SDS 浓度在 0.5%以下， 尿素在 2M 以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无 沉淀。 二、实验步骤 1.抗原准备：每只小鼠按照 100ug/100ul 蛋白质或多肽置于生理盐水 中制备成抗原。 2.抗原 -佐剂的准备： 将抗原液与佐剂混合制成乳状液， 抗原与佐剂混 合按照 1：1 比例进行，加入搅拌子后于 4 度搅拌过夜。注射量为 200ul 每只小鼠，抗原量为 100ug。 第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后 加强使用弗氏不完全佐剂， 最后一次加强不加佐剂， 免疫前采集阴性 血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。 乳化完全判断标准： 挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否 稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。 将乳状液移入 1ml 注射器。 3.小鼠免疫： 将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部 75%酒精 消毒，针头 15 度角刺入小鼠皮下， 挑起注射 。皮下注射共 200ul ，分 5 个点（背部皮下任意点） mice 途径 佐剂 剂量（ ug ） 与上次免疫间隔时间 首次免疫 皮下（ SQ ）5 点 FCA 100 0 第一次加强免疫 皮下（ SQ ）5 点 FIA 50 2 周（ 14 天） 第二次加强免疫 皮下（ SQ ）5 点 FIA 50 1 周（ 21 天） 效价检测 2 周（ 35 天） 冲击免疫 脾脏（ IV ） 100 融合前 3 天 4.冲击免疫：如计划在免疫 3d 后进行细胞融合实验，则使用 水相溶 解的游离抗原 进行直接脾脏免疫。 过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪 开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取 100ul/100ug 抗原注入脾脏内，并 快速用手术线分别缝合内皮和外皮。 5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血 20ul ，用生理盐水稀释 10 倍， 离心收集上清。 6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。 包被 ： 抗原使用 PBS 缓冲液，浓度 1ug/1ml,每孔加入 100ul 溶 液，4 度包被过夜 酶： 羊抗鼠 IGG-HRP，1：5K 样品 ：20%小牛血清的 PBS 梯度稀释