XXXX年分子生物学实验.pptxVIP

分子生物学实验; 要 求 1、实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动。 2、课前预习、课中认真操作和课后的实验报告。 3、妥善保管好每组的实验器具。 4、实验操作要求人人动手。 5、每次实验完毕要验加样枪的准确性，然后做好值日卫生工作。;第3周;时间分配; 学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将T载体上所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到表达载体上。;实验材料： 外源片段DNA——CHY基因的PCR产物； 载体——pET28a-egfp（含有绿色荧光蛋白DNA片段??； BL21感受态细胞（鼎国公司）； 培养皿； 37℃摇床及培养箱。 实验试剂： 限制性内切酶(EcoRI; XhoI) （TaKaRa公司）； T4 DNA连接酶； LB液体培养基和固体培养基； 卡那霉素（kana）:工作浓度100μg/mL； 氯仿/异戊醇（24:1）；无水乙醇；3M NaAc；70%乙醇；ddH2O。 ;四、实验步骤 ;6．连接反应（15μl体系）：;8.制备含有适当抗生素的LB培养基平板。 9.筛选培养： 取转化反应液200 ?l，均匀涂布于含有Amp抗性的LB培养基平板上。 将涂布好的平皿置37?C平放20 min，然后倒置培养12-16 h。 （期间应注意观察，当菌落生长良好，而相邻菌落尚未相互重叠时，即停止培养。若发现菌落太多或太少时，应改变转化反应液的用量，重新涂布培养。 ） ;1. 使用酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10以下，否则，酶活性将受影响。 2. 吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。 3. 加试剂前，应短促离心10秒钟，然后再打开管盖，以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染。整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等应是新的，并经高压灭菌处理。 5. 离心操作一定要在低温下进行，所用的水、Eppendorf管都要在冰上预冷，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 6. 37℃振荡培养时间不宜过长，否则会出现很多的卫星菌落和轻微的菌膜干扰。 7. 平板涂布重组体时，应避免反复来回涂布，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂、死亡，影响转化效率。 8. 涂布后培养时间不宜超过24h，否则会出现卫星菌落。;试验设定二组，1、宿主菌涂布；2、转化连接产物的受体菌涂布。 最后比较培养好的平皿，可以看到： ① 含抗菌素培养皿上的受体对照组并没有长出菌落，证明受体菌对抗菌素是敏感的，并证明在本实验中没有发生抗药性突变。 ② 转化连接产物的受体菌在含抗菌素的培养皿中也长出了菌落，这不是受体菌的抗药性的自发突变株，肯定是质粒DNA转入细菌后的转化体，这是因为带抗药性的质粒DNA转入细菌后，使转化体产生抗药性这一遗传特性的结果。; 由于此实验过程涉及多个实验环节，如酶切、连接、感受态细胞、转化等各方面的效率，因此在实验中经常会出现一些问题。如： 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 2.DNA浓度过低时可适当浓缩后再酶切，浓度过高可能酶切不完全可以适当稀释酶切。 3.反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应，如果底物DNA较多可以延长酶反应时间。;1.限制性酶切反应及DNA连接反应要注意哪些要点？ 2.如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动，你认为可能是什么原因？ 3.转化后，涂布之前为何要在400μL LB培养基中培养1h ？ 4.如何制备平板？重组体涂布时应注意哪些操作？ 5.影响转化的主要因素有哪些？