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影响电穿孔导入DNA的因素： 外加电场的强度 哺乳动物：250-750V/cm 酵母一般在1500V/cm 电脉冲时间20-100ms； 工作温度0-25℃； DNA构象和浓度，线状比环状好，浓度1-40u/ml； 阻抗：200-400Ω 重组DNA导入链霉菌中 原生质体转化 接合转移 电脉穿孔 噬菌体转染与转导 （一） 原生质体法 1：制备: 2ml新鲜种子液接入50ml培养基?28℃培养?离心收集菌体（3000rpm 10min）?菌丝体用10.3%蔗糖洗涤两次?悬浮于溶菌酶溶液中? 30 ℃培养?相差显微镜观察原生质体形成?温和离心?除去菌体? 上层溶液离心?收集原生质体?悬浮于P溶液中 2：转化： 20ul重组DNA ? 0.05ml原生质体（显微计数106) ?混匀，立即加0.5ml T缓?加入0.5ml P缓?离心?沉淀悬浮于1ml P缓?200ul 涂平板?30 ℃培养想培养至菌落长出 （二）接合转移 DNA以单链的形式进入宿主菌。从大肠杆菌到链霉菌质粒的转移需要顺式转移起始点(oriT)和反式转移功能（tra）。供体一般用大肠杆菌S17-1菌株，它含有具接合功能的整合型RP4，可以介导质粒的转移，在链霉菌受体中DNA可以以质粒的形式或整合形式存在 （三）电穿孔 在电脉冲条件下，质粒DNA可以从细胞中释放或被吸收。Devies J等利用S.paroulus and S.vinaceus NCIB 8852 整个菌体进行电穿孔，比原生质体转化效率提高10-100倍。将含质粒的链霉菌菌丝悬液与大肠杆菌感受态细胞用电脉冲刺激，可以将质粒直接转移至大肠杆菌。 （四）噬菌体转染与转导 对于某些限制修饰较强的链霉菌，该法比较有效。应用带正电荷无DNA脂质体可增加转染的效率。 转化率 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为： 每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长） 转化子的筛选和鉴定（检） 载体遗传标记检测 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 基本原理： 利用载体上的遗传学标记如抗生素抗性基因,外源基因插入载体并转入受体细胞后，使受体细胞获得或缺失这些标记表型 。 插入失活法 插入表达法 抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子 插入灭活法(insertion inactivation) 适用于具有两个或两个以上选择标记的质粒 如:pBR322的双抗生素抗性标记 可鉴别出重组体和非重组体 插入表达法 二.营养缺陷型筛选法（遗传互补法） 其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。 显色筛选法的基本原理： 载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。 蓝白筛选 pUC载体及其衍生质粒含有lacZ基因 该基因编码大肠杆菌β-半乳糖甘酶α氨基端的α互补肽段， 宿主细胞的β-半乳糖甘酶α缺陷型。 在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，含有该类载体的宿主细胞的两个互补肽段产生活性，可分解培养基上的底物—5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal），形成蓝色菌落。 当外源基因插入lacZ基因内部的多克隆位点，X-gal的培养基的重组子由于lacZ基因的插入失活而呈白色，而含有空载体的宿主细胞显蓝色，从而达到被鉴定筛选的目的。 化学合成法的基本策略 全基因合成 上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95% 则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7% 重组DNA技术的操作过程 A ：DNA的体外重组（切、接） B ：重组DNA分子的转化和扩增（转、增） C ：转化子的筛选和鉴定（检） 第五节 DNA