基因克隆载体.pptVIP

1)SV40 DNA的一般特性 SV40 DNA为环状双链DNA（5243bp），与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome） SV40 DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录 SV40基因转录图 SV40 DNA单识别位点限制性内切酶位点 限制性内切酶 识别位点 Kpn I 294 Nae I 343 Hpa II 346 Hae II 832 EcoR I 1782 BamH I 2533 BstX I 2759 Taq I 4739 Bgl I 5235 2） SV40-DNA的转录、复制与增殖 SV40 感染并进入细胞 病毒DNA进入细胞核 进行早期转录，合成T抗原 启动病毒DNA复制 晚期转录，合成包装蛋白 组装成病毒颗粒，细胞裂解 3） SV40 DNA衍生的克隆载体的构建 构建SV40 DNA衍生克隆载体的策略 a) 保留完整的T-抗原基因. b) 保留复制起始点(Ori), 间隔区和终止序列 c) 替换晚期转录区基因或部分早期转录区. SV 40 DNA晚期转录区取代型载体 重组病毒质粒载体 含有完整早期区段和复制起始点的病毒质粒载体 2. 腺病毒克隆载体 腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面体病毒，含有一个线性双链DNA分子。Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列IRT．在每一条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白（5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后，通过该蛋白连接成环状． 腺病毒结构 腺病毒DNA的结构 结合蛋白 反向重复序列 腺病毒克隆载体的构建 第五节 反转录病毒衍生的克隆载体 反转录病毒（retrovirus)是一类含RNA的病毒．感染到动物细胞后，病毒RNA通过反转录产生双链DNA分子，可整合到宿主细胞染色体上或成为原病毒，随染色体DNA进行复制、转录和翻译． 1.劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV) 1）RSV基因组的特点 基因组由四条RNA分子构成， 两条38S RNA编码病毒的全部遗传信息，两条较小的RNA分子为宿主细胞的tRNATrp． 38 S RNA链带有两段相同的r序列的非编码区，分别位于5’-末端和3’-末端. RSV病毒RNA分子结构 （非编码序列） 　被膜基因　聚合酶基因　抗原基因　 2）RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译 3)反转录病毒克隆载体构建策略 a）从感病细胞中分离原病毒DNA. b）根据不同需要引入选择标记、外源基因及 DNA 复制的启动子. c）与质粒载体重组构建反转录病毒克隆载体 d）转化受体细胞 e）包装成新的反转录病毒颗粒. f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基 因导入动物细胞. 第六节 基因定位整合克隆载体 为了保证外源DNA在细胞中稳定遗传并不对宿主细胞的代谢产生较大的影响，建立基因整合平台系统，使外源基因定位整合到染色体特定的位点．它包括整合平台和整合克隆载体两部分． 整合平台：受体细胞基因组上给定的DNA区域． 整合克隆载体：含有一个或两个与整合平台区核苷酸序列同源的DNA片断． 外源DNA整合到染色体上 1.定位整合克隆载体的种类 1) 内源平台双交换置换克隆载体 1.2 λ基因组DNA的结构 ?噬菌体的组装 1.3 λ噬菌体载体构建的策略 a)去除部分限制酶识别位点 b)去除非必需区DNA J-N；P-Q c)插入可供选择的标记基因 常用的λ噬菌体衍生载体 载体名称 分子大小(kb) 可克隆外源DNA片段大小(kb) Charon 3A 4.83 0 – Charon 4A 　 4.54