Fret荧光共振能量转移.pdf

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions Fret 荧光共振能量转移 对于分子生物学来讲，生物分析手段的发展，是阐明机理的必要条件。在研究分子间相互作用的道路上，人们不断 探索，总结出很多方法， 免疫技术， 晶体衍射， 核磁共振等。 1948 年，荧光共振能量转移 （Fluorescence resonance energy transfer ， FRET ）理论被首次提出，它可以测定1.0-6.0nm 距离内分子间的相互作用。 年，这一理1967 论得到了实验验证，将 1.0-6.0nm 的距离称为光学尺。二十世纪八十年代出，通过科学家的不断探索， 技术 成功运用到蛋白质结构的研究中。自 Fret 荧光共振能量技术诞生以来，已结合多种先进的技术和方法，如电子显 微镜，X 射线衍射等，推动了分子生物学检测手段的发展。 作用原理 荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法。 他适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。 此方法的检测原理如下； 将我们要检测的蛋白 （如图X 和 Y ），分别偶联上 D 和 A 荧光蛋白，D 和 A 是一对荧光物质， 我们称之为供体 （donor ） 和受体（ acceptor ）。当用430nm 的紫光去激发 X 融合蛋白时，它能够产生 490nm 的蓝色荧光；同样，当我们 用 490nm 的蓝光去激发 Y 融合蛋白时，它能够产生 530nm 的黄色荧光。（结合图 1 ） 。 当蛋白 X 和 Y 间没有相互作用时（两者的空间距离 10nm ），融合蛋白X 和 Y 分别产生相应的荧光而被检测到，如果蛋白 X 和 Y 间存在相互作用（两者的空间 距离需 10nm ，结合图2 ），用紫光激发融合蛋白 X 其产生的蓝光会被融合蛋白 Y 吸收，从而产生黄色荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝色荧光的存在。这时 因为能量从 X 融合蛋白转移到了 Y 融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。 技术难点 Tel: (025) 5889- 4959 www.DetaiB Sales@DetaiB 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 一个理想的 Fret 相互作用体系，要求要有一对合适的荧光物质， 即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重 叠。且当供体的激发波长时对受体无影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱干涉，而使反应 体系不稳定。目前，较为常用的供体 - 受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（ GFPs CFP-YFP ， BFP-GFP ， BFP-YFP等，染料类的有 Cy3-Cy5 ， FITC-Rhodamine 等。且这些荧光物质要能够标记在 研究对象上。 应用要求 供体荧光基团和受体荧光基团的空间距离要 10nm ； 供体的发射光谱与受体的接收光谱有相当的重叠； 供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面要求较高。 优缺点 优点