细胞增殖及细胞活力检测方法.pdfVIP

细 胞 增 殖 及 细 胞 活 力 检 测 方 法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。 一种是直接的方法， 通过直接测定进行分裂 的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（ cellviability ）检测方 法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。 显然， 细胞活力检测法并不能 最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。 如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序， 但 药物的干扰可抑制凋亡的发生； 这时若采用细胞活力检测法， 显然可以区分两种条件下的细 胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结 论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞， 再检测 DNA 链 中氚含量。若细胞具有增殖能力， DNA 合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合 成原料，因此检测细胞 DNA 链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行 DNA 的合成。 但更为常用的方法是 BrdU 检测法。 用 BrdU 预处理的细胞中， BrdU 可代替胸腺嘧啶核苷插 入复制的 DNA 双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和 变性处理后，可用免疫学方法检测 DNA 中 BrdU 的含量（如采用鼠抗 BrdU 单克隆抗体特 异识别 BrdU, 再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠 IgG 二抗标记， 最后用比色法或荧光的方 法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD 公司提供一种 BrdU 检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、 变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在 450nm 下读数，所有操作在 3小 时内结束。 而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。 1000个细胞以上水 平的检测只需用 BrdU 预孵育 2小时， 100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能 力。 BrdU 法的一个缺点是需要固定和变性等破坏 DNA 的处理。有些情况下，研究者可能希望 在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总 DNA 含量，然而，在变性条件下， DNA 的双链 结构将被破坏， DAPI 和 Hoechest33342等核酸标记探针就不再能识别 DNA ，因而也无法估 计 DNA 总量。 MolecularProbes 公司的 Click-iTEdU 检测试剂盒可以解决这个问题。这种方 法不需要变性步骤， 因为荧光探针标记的叠氮化物小分子， 而不是庞大的抗体分子， 可以很 轻易的识别并结合未变性 DNA 双链中的 EdU 分子。 采用 BrdU 方法时，你必须非常小心的去对 DNA 进行变性，才能一方面使 BrdU 抗体进入 细胞，另一方面又保留足够的双链 DNA 分子来进行细胞周期的分析。有了 EdU 后则不同， 由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于 DNA 变性的 HCl ，可能破细胞 内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了 BrdU 检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情 况在 EdU 法中不存在。 图1：EdU 及 BrdU 原理示意图（