猪伪狂犬病病毒基因序列分析.docVIP

1 猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析 摘要：根据Genbank中已发表的猪伪狂犬病病毒〔PRV〕gE、TK基因的序列各设计了1对引物，对别离得到的PRV毒株的gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序，测序结果与预期的PRV gE、gG、TK基因片段相符。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV毒株的gE、gG、TK氨基酸序列发生变化的位点与2021年国内别离到的 PRV流行株相同，从而推测该毒株为PRV变异毒株。 关键词：伪狂犬病毒；gE基因；TK基因；序列分析 猪伪狂犬〔Pseudorabies，PR〕是由伪狂犬病毒〔Peudorabies virus，PRV〕引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病[1]。该病在我国发生较为严重，是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国目前广泛应用的是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株，使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是，2021年底至2021年该病在中国东北局部省份流行，甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情，给中国的养猪业造成了巨大的经济损失[2-6]。 伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒，大小约150kb，DNA基因组中G+C的含量高达73%，可编码100种蛋白质。基因组由独特的长节段(UL)、独特的短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)和末端倒转重复序列(TRs)组成。在病毒的结构蛋白中，gE糖蛋白是主要毒力因子之一，并作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染。TK基因不仅是最主要的毒力基因，而且也是决定病毒持续感染的重要因素[7]。一旦TK基因缺失，PＲV变异株对宿主的毒力将丧失或明显降低。 2021年至2021年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病〔Bartha〕疫苗的规模化猪场成功别离并鉴定出四株PRV，命名为SX1，SX2，SX3，SX4株，为明确该四株别离株是否属于PRV抗原变异毒株，本研究对PRV SX株的gE、gG、TK全基因进行克隆和测序，通过与国内外其他已公布PRV别离株的gE、gG、TK推导的氨基酸序列进行比对，构建核苷酸序列遗传进化树，以期为丰富PRV分子流行病学和开发科学有效的新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1 毒株、菌种和质粒 PRV SX株由上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍课题组别离并保存；pMD-19T载体购自宝生物工程〔大连〕；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技〔北京〕。 1.1.2主要试剂 病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒〔DP315〕、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技〔北京〕；T4 DNA连接酶、TaKaRa LA Taq with GC Buffer均购自宝生物工程〔大连〕。 1.2方法 1.2.1引物设计与合成 参照GenBank中PRV gE、TK基因序列，利用 Primer Primer 5.0软件，设计2对引物。引物序列：上游引物gE-F:5’-atgcggccctttctgctgcg-3’，下游引物：gE-R:5’-ttaagcggggcgggacatca-3’。上游引物gG-F:5’- atgaagtgggcaacgtggat-3’,下游引物：gG-R:5’-tcaggcggaggccacgtgg-3’，上游引物TK-F：5’-atgcgcatcctccggatcta-3’，下游引物：TK-R：5’-tcacacccccatctccgac-3’，分别用于扩增gE、gG、TK全基因。 1.2.2 病毒基因组的提取与扩增 取200μL病毒悬液于1.5mL离心管中，反复冻融3次，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒〔DP315〕说明书提取病毒DNA。用所设计的特异性引物进行PCR扩增。取10μL PCR产物，置于浓度为10g/L的琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒切胶纯化回收后与pMD-19T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性重组质粒送测序。 1.2.3 目的基因的序列分析 采用DNAStar生物软件对PRV所测定的gE、TK基 因推导的氨基酸序列与GenBank中收录的其他国内外毒株的序列进行比对，并构建gE、TK基因核苷酸序列的遗传进化树。 2 结果与分析 2.1病毒gE、TK基因的PCR结果 以PRV SX株病毒基因组DNA为模板，用PCR的方法分别扩增出约1740bp，1500bp和963bp的基因片段，琼脂糖凝胶电泳图显示目的基因片段条带大小与预期结果符合〔图１，图2，图3〕。PRV SX株gE、gG、TK基因的测序由上海生工生物科技完成。gE、gG、TK基因去除起始密码子和终止密码