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第十八章 重组DNA技术 Chapter 18 Techniques of Recombinant DNA;◆ DNA分子体外重组技术和核苷酸序列分析技术标志了基因工程时代的诞生。;◆ 遗传工程(Genetic Engineering)：借助生物学技术，对生物遗传物质进行更改和/或重新组合，以改变生物的遗传性状或创造新的生物品种的遗传学研究技术。;;第 一 节 重组DNA技术中的酶 Section 1 Enzymes in DNA Recombination;酶;一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme );3. 限制酶的分类 根据作用特征可以分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三种类型 (1) 三型限制酶的基本特征;(2) Ⅱ型限制性核酸内切酶;5 ··· GAGCT C ··· 3;Sma I;二、DNA连接酶(DNA ligases);;第二节 载 体 Section 2 Vectors;◆ DNA载体：是指具有接受外源DNA片段并能导入宿主细胞进行自主复制的特定DNA分子。;(3) 不能插入到基因组中，易于分离和纯化 (4) 含有选择性标记 (5) 含有克隆位点 (5) 具有适当的长度;一、克隆载体;质粒pBR322示意图;(2) pUC系列质粒 ◆ 由pBR322改建而成，主要特征为：;;◆ pUC系列质粒的优点： ① 具有更小的分子量和更高的拷贝数 ② 适应于组织化学筛选重组体(蓝白斑实验) ③ pUC系列提供多克隆位点(MCS);3. 人工染色体;二、表达载体;1. 原核表达载体;(2) 原核表达载体表达特点： ① 非融合型表达蛋白 ② 融合型表达蛋白 ③ 分泌型表达蛋白;Xho I(158) Not I(166) Eag I(166) Hind III(173) Sal I(179) Sac I(190) EcoR I(192) BamH I(198) Nhe I(231) Nde I(238) Nco I(296);T7启动子;;① 选择性标志;④ 上游活性序列;(2) 酵母表达载体的表达形式;3. 哺乳动物表达载体;哺乳动物表达载体pcDNA3.1;第 三 节 重组DNA操作的基本过程 Section 3 Protocols of DNA Recombination ;DNA重组的基本过程： 1. 靶基因DNA片段的制备 2. 适宜载体的选择和制备 3. DNA片段与载体的连接 4. 重组DNA转化宿主细胞 5. 含有重组DNA宿主菌的筛选 6. 重组DNA分子的鉴定;基因组DNA;转化;;一、目的DNA片段的制备;;◆ cDNA文库(cDNA library)：提取细胞总mRNA，经反转录获得总cDNA，每一个cDNA分子与载体连接产生了一个重组DNA分子的混合物，再转化宿主菌，每个宿主菌细胞克隆将含有一个cDNA重组分子，这些克隆的集合体被称为cDNA文库。;;二、载体的选择与准备;三、DNA分子的体外重组;Bam HⅠ切割反应;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;四、重组DNA分子导入宿主细胞;2. 转染;3. 感染;五、重组子的筛选与鉴定;(插入失活法) 抗药性标记选择;3.α-互补法 (即蓝白斑筛选法); α 互补的检测 ;组氨酸缺陷 型大肠杆菌;5. 核酸分子杂交筛选;6. PCR法进行鉴定;7. DNA序列分析鉴定;第 四 节 外源基因的蛋白质表达 Section 4 Expression of Recombinant Gene;◆ 重组基因表达体系的创建过程包括： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离、纯化等技术。;一、原核表达体系;◆ 缺点：需要去除原核多肽。 ◆ 原核多肽切除方法：化学裂解法和酶解法。;◆ 包涵体益处：防止蛋白酶对表达蛋白的降解，有利于表达产物分离纯化。;二、真核表达体系;2. 哺乳动物细胞表达体系 ◆ 优点： ① 可表达克隆的cDNA，也可表达真核基因组 DNA。 ② 表达蛋白可被适当修饰。;三、重组蛋白质