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选修 1 《生物技术实践》知识点归纳
实验 1 大肠杆菌的培养和分离
1. 微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物,包括病毒、原核生物、原生生物
和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物,有细胞壁(肽聚糖) 、细胞膜、细胞质,无成型的细胞核,只有一环状 DNA
分子(拟核) 。以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏
染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。大肠杆
菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜) 、兼性厌氧的肠道杆菌。
2. 细菌的分离方法有两种:划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的
最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线的过程中菌液逐
渐减少,细菌也逐渐减少, 。划线最后,可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养 10~20 小时后,一个
细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞,形成菌落,不会重叠。在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生
的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中
通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因) ,如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌的其他杂菌都没
有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。
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涂布分离时, 需要先将培养的菌液稀释, 通常稀释到 10 ~ 10 之间,然后去不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固
体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落。通常每个培
养皿中有 20 个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后,再做功能性实验。
划线分离法,方法简单;涂布分离法,单菌落更易分开,但操作复杂。
3. 在培养微生物时,必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的,各种培养基也必须是无菌的,转移
培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌(防止杂菌污染) 。进行恒温培
养时,要将培养皿倒置,是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发,倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后,落
入培养基的表面并且扩散, 菌落中的细菌也会随水扩散, 菌落见相互影响, 很难在分成单菌落, 达不到分离的目的。
4. 细菌扩大培养要用 LB 液体培养基(通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业) ,划线分离要用 LB 固体培养
基(常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存) 。“细菌喜荤,霉菌喜素” ,通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提
取物来配制,还要加入一定的氯化钠,以维持一定的渗透压;霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即
可。尽管培养基的配方各不相同,但其基本成分都一样(五类) 。
人及动物的营养物质:水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类;
植物的营养物质:矿质元素、水、二氧化碳等三类;
微生物的营养物质:水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。
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4. 无菌技术
(1)获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵,
要注意以下几个方面:
①对实验操作的空间、 操作者的衣着和手, 进行清洁
和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、 接种用具和培养基等器
具进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染, 实验操作应在酒
精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经
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