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软琼脂集落形成实验 软琼脂集落形成实验 PAGE / NUMPAGES 软琼脂集落形成实验 一、目的：确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量。 二、原理：肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落，而成熟分化的细胞则不能形成集落。 CHO-EGFP 和 CHO-ECRT39/272 细胞在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中 形成集落，其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力。 三、操作 ???1．收集对数生长期的细胞 （如何鉴定） ，先测定细胞活力 并进行活细胞计数，然 后调整细胞浓度，用含 20%FBS 的 DMEM 制成 1000 活细胞／ ml 的细胞悬液。 2．用蒸馏水制备 1.2%、0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖，高压灭菌后，维持在 40℃不会凝固； 3．1.2%琼脂糖和 2xDMEM 等体积混合， 6 孔板中加入 1.4ml， RT 凝固作为底 层琼脂，置 CO2 温箱中备用； 4．0.7%琼脂糖和 2xDMEM 等体积混合，再加入细胞悬液充分混匀， RT 凝固作 为上层琼脂，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。在室 温放置 20 分钟使细胞琼脂悬液凝固。 ???以上各步骤均在无菌条件下进行。 ???5．然后移培养板或平皿于 CO2 培养箱中 37℃进行培养。 ???6．培养 7～l0 天，肉眼观察并计数细胞集落。 四、结果：以肉眼可见的细胞团 (含 500 个以上细胞 )作为计数集落的标准。集落的计 数和计算：集落数 =n 孔中细胞集落数总和 /n 孔， ???集落形成率 =集落数 /接种培养细胞总数 ×100％ 精心整理