血红蛋白的提取及分离.docx

“血红蛋白的提取和分离 ”的实验分析及教学 组织 人民教育出版社课程教材研究所 吴成军 东北师范大学附属中学 赵伟涛 “血红蛋白的提取和分离 ”是人教版选修模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的 是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽 然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，因此，学生的学习兴趣很高。下面结合人教 版教材对该实验进行分析并提出相应的教学建议。 1. 习得实验原理和方法 1． 1 初步获取血红蛋白的原理和方法（样品的处理和粗分离） 实验步 骤 ①洗 涤 红细胞 ②释 放 血 红 蛋 白 实验目的 获 取 较 纯 净 的 红 细 胞 破 裂 红 细 胞， 释放血 红蛋白 实验原理 通过离心将密度 不同的物质分离 低渗溶液中红细 胞破裂； 甲苯溶解 膜脂， 加速细胞破 裂（相似相溶原理） 操作方法 低速离心，去除 上清液，反复加 生理盐水并离心 加蒸馏水，再加 甲苯，磁力搅拌 器充分搅拌 结果判断 直 到 上 清 液 未 呈 现 黄 色 为止 无明显现象 ③分 离 初 步 得 到 通过离心将密度 血 红 蛋 血 红 蛋 白 不同的物质分离 离心（较高速） 试 管 溶 液 分 为4层 白溶液 ④透析 溶液 去 掉 液 体 小 分 子 物 质 透析（ 12小时） 中 的 小 分 容易透出透析袋 子物质 透 析 袋 中 物 质 的 颜 色 更 红 1． 2 分离纯化蛋白质的原理与方法──凝胶色谱法（分子筛效应） 凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体， 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时， 相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部 的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩 散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最 后流出层析柱。而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒 间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质， 虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的 速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 需要注意的是，有部分小分子蛋白质未进入凝胶内部，而在外部移动，因此，如果需要 得到纯度更高的蛋白质分子，可将色谱柱中的凝胶溶液进行平衡后进行再次冼脱和分离。 1． 3 鉴定蛋白质纯度的原理与方法──电泳 蛋白质分子的基本单位是氨基酸， 氨基酸的一些基团在一定的 pH 下会发生水解或电离从 而带有电荷。但总的来说蛋白质分子一般带有负电。在电场的作用下，带电的蛋白质分子会 向着电泳槽中的正极方向移动。由于样品中各种蛋白质分子净电荷的量的差异以及蛋白质分 子本身的大小等因素，使蛋白质分子产生不同的迁移速率，从而将样品中各种蛋白质分子分 离开。 由于蛋白质分子带电电荷比较复杂，净电荷总量与蛋白质分子的质量不成正比，而蛋白 质分子的质量又是衡定的，电泳时在带电量和分子质量两种因素的作用下会产生迁移速率的 复杂化，不能正确地将分子质量不同的蛋白质分子分离开，因此，实际操作中，一般会将蛋 白质分子与 SDS（十二烷基硫酸钠） 发生反应形成蛋白质 —SDS复合物， 由于 SDS所带负电荷 的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使蛋白质 的迁移率完全取决于蛋白质分子质量的大小。在电场条件下，分子量大的蛋白质迁移率慢， 离前沿较远，而分子量小的蛋白质迁移快，离前沿较近。这样，不同分子量大小的蛋白质得 到了分离。如果蛋白质的纯度高，迁移率一致，就会形成前沿整齐、清晰的条带。 2. 正确定位教学目标 以上原理和方法中， “初步获取血红蛋白的原理和方法 ” 比较简单，又有必修的基础， 因此学生容易理解；凝胶色谱法的原理容易理解，但操作复杂，难度较高，是学生学习的重 点；电泳的原理和方法比较复杂，绝大多数学校目前缺乏相应的实验设备，而且是用于鉴定 分离后蛋白质纯度的后续实验，因此可作为选学内容。基于以上分析，特确定如下的教学目 标、教学的重点和难点。 2． 1 教学目标 （ 1）说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。 （2）说明凝胶色谱法的原理和方法。 （3）说出电泳的基本原理和方法。 （4）进行样品的预处理。 （5）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。 2 ． 2 教学重点和难点 教学重点：凝胶色谱