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精品文档 精品文档 PAGE / NUMPAGES 精品文档 生物大分子的分别纯化 由于生物体的组成成分是如此简单，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不行能有一个适合于各类分子的固定的分别程序，但多数分别工作关键局部的根本手段是相同的。为了避开盲目，节省试验探究时间，要认真参考和借鉴前人的阅历，少走弯路。常用的分别纯化方法和技术有：沉淀法〔包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等〕、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。 1 沉淀法 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法〔即溶解度法〕操作简便，本钱低廉，不仅用于试验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分别纯化生物大分子，特殊是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分别。 此方法的根本原理是依据不同物质在溶剂中的溶解度不同而到达分别的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的转变或参加某些沉淀剂以及转变溶液的pH值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的转变。 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴ 中盐沉淀〔盐析法〕：多用于各种蛋白质和酶的分别纯化。 ⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分别纯化。 ⑶ 选择沉淀〔热变沉淀和酸碱变沉淀〕：多用于除去某些不耐热的和在肯定pH值下易变的杂蛋白。 ⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是进展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇〔Polyethyene glycol〕作为沉淀剂。 1.1 中盐沉淀〔盐析法〕 在溶液中参加中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分别，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使很多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保存在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①本钱低，不需要特殊昂贵的设备。②操作简洁、平安。③对很多生物活物质具有稳定作用。 ⑴ 中盐沉淀蛋白质的根本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子四周形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，减弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子外表极基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中盐的亲水大于蛋白质和酶分子的亲水，所以参加大量中盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页"图2－1"所示。 ⑵ 中盐的选择 常用的中盐中最重要的是〔NH4〕2SO4，因为它与其他常用盐类相比有格外突出的优点： ① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下〔0～4℃〕进行。由下表可以看到，〔NH4〕2SO4在0 表2－1 几种盐在不同温度下的溶解度〔克/100毫升水〕 0 20 80 100 〔NH4〕2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ② 分别效果好：有滇取液参加适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 ③ 不易引起变，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L的〔NH4〕2SO4保存可达数年之久。 ④ 价格廉价，废液不污染环境。 ⑶ 盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵参加法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，参加之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量屡次地参加，尤其到接近方案饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避开局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可接受离心分别，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示