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核酸杂交检测技术 核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一 , 近年来正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速 诊断。杂交的 基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。用于诊断目的的杂交双方是已知序列的病毒探针和待 测样品中的病毒核酸 , 杂交后通过特定方法检测。如有杂交信号 , 则说明样品中存在病毒核酸 , 进而证明病 毒感染的存在。 待测的病毒核酸可以从病料中提取 , 也可以从纯化的病毒粒子提取。 提取后可在膜上与探 针杂交 ( 固相杂交 ) 。或直接在试管 的杂交液中杂交 ( 液相杂交 ), 此外 , 也可直接在组织切片或细胞涂片上 对细胞中的病毒核酸 进行杂交 ( 原位杂交 ) 。下面重点介绍如何建立杂交体系及适用于病毒诊断的几种杂交 方法。 ( 一) 建立杂交体系 核酸杂交是多种环境因素与二条互补 核酸链综合作用的结果 , 它有较 高的技术要求。了解各种组份及反应条件对杂交的影响是建立杂交体系 , 获得理想结果的基础。 1、温度 杂交反应中 , 双链核酸的变 性与复性主要是温度控制的。选择适当的杂交和洗膜温度是实验成败最关键 的因素之一。杂 交反应通常在低于解链温度 (T m值 )15 ～25℃的条件下进行。 T m值受核酸链组成 (G+C) 、溶液的离子强度、 pH值及反应体系是否含变性剂等的影响。 在杂交体系不含变性剂的情况 下 ,DNA 之间的杂交反应通常在 68℃进行 , 当含 50%变性剂甲酰胺 , 则在 42℃进行。 2、pH值 杂交体系的 pH 在 5～ 9 的范围内对复性无明显影响。杂交反应通常在 pH6 5 ～ 7 5 之间进行。较高的 pH值产生更严格的 杂交条件。 3 、盐离子浓度 体 系 中往往加入单价离子的盐 , 因为单价阳离子与核酸链上的磷酸基团 发生静电反应 , 所以能降低 核酸链之间的静电排斥 , 维持双链 DNA的稳定性。盐浓度增加 , 稳定性提高。杂 交体系中通常 采用 6 倍 SSC(1 倍 SSC为 0 15 mol/L NaCl 和 0 015mol/L 柠檬酸钠， pH7 0) 缓冲液。 4、变性剂 杂交体系中加入变性剂可降低 T m值 , 所以杂交可在更低的温度下进行 。常用变性剂是甲酰 胺。 5 、 DNA浓度 浓度愈高 , 复性速度愈快。所以杂交反应中应加入足够的探针 , 还应尽量减少杂交体 积 , 一般每百 cm 2 滤膜用 2 5ml 杂交液。 6 、探针长度 溶液中 DNA复性率与片段长度的平方根成 正比。所以用长的 探针可获得高的复性率。但原位杂交通常用较短的探针 , 以减少探针进入细胞并扩散到 靶核酸的阻力。 7 、硫酸葡聚糖 在水溶液中 , 此化合物表面可吸附 DNA探针分子 , 从而浓缩探针 , 促进 二条核酸链间的缔合。其 10%的浓度可提高杂交速度 10～ 100 倍 。使用硫酸葡聚糖可能导致背景加深 , 所 以一般在探针浓度过低的情况下才使用。 8 、杂交时间 它受探针的长度与浓度、反应体积等因素的影 响, 较短的探针、 较高 的探针浓度和较小的杂交体积 , 需要较短的杂交时间。 一般来说 , 杂交时间通常在 2 ～ 16 小时。 9 、预杂交 在杂交前进行预杂交 , 封闭非特异的 DNA结合位点 , 降低非特 异杂交 , 是杂交的 前提。常用的封阻试剂有非特异性的 DNA(鲑鱼精子 DNA或小牛胸腺 DNA)和大分子化合物 ( 聚蔗糖、聚乙烯 吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等 ) 。 10、碱基 错配 杂交中碱基错配将明显提高