维生素B2的分子荧光测定(精).ppt

* * 维生素B2的分子荧光测定 一、目的要求 １、了解分子荧光分析法的原理。 ２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 ３、掌握荧光光度计的基本操作方法。 二、方法原理 维生素B2又称核黄素,溶于水,在W为0.05的乙酸溶液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm），在所确定的波长条件下，测定维生素B2标准系列溶液的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物样品（蔬菜）中的维生素B2含量。 第一页，编辑于星期日：九点 七分。 三、实验步骤 1．标准系列溶液的配制 用吸管移取维生素B2标准贮备溶液10.00mL于100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg·L-1) 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL，分别放入六只100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为0,0.050,0.10,0.20,0.30和0.40 mg·L-1。 第二页，编辑于星期日：九点 七分。 2.样品溶液制备 称取50g新鲜蔬菜，加40mL水压汁，将菜汁加入20mL1mol.L-1HCl和10mL水煮沸1h，冷却，不断搅拌滴加2mol.L-1NaOH，调节pH为6，再用稀HCl调节pH至4.5，过滤，用水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 第三页，编辑于星期日：九点 七分。 3.工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光强度与浓度的工作曲线。 4.测定 分别吸取10.00mL样品溶液三份，依次置于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋酸，再加入KMnO4溶液(3%)0.5mL，放置2min，边摇边滴H2O2(30%)，使KMnO4刚好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计上分别测定其荧光强 第四页，编辑于星期日：九点 七分。 四、结果处理 1.在坐标纸上绘制If~C的工作曲线 2.根据测定的If.x，从工作曲线上查出溶液中维生素VB2的Cx（mg/L） 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素VB2的含量（mg/100g） VB2 （mg/100g）= Cx ×25.00×10-3 × （100/10）×（1/WS）×100 第五页，编辑于星期日：九点 七分。 * *