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PAGE PAGE #/10 淀粉酶活性的 测 定 杭场 098 廉硕 0901080808 摘要：淀粉酶是水解淀粉的糖昔键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作 用方式，可以分成*淀粉酶，p-淀粉酶等。*淀粉酶和彷淀粉酶是其 中最主要的两种。卩■淀粉酶存在于休眠的种子中，而a■淀粉酶是在 种子萌发过程中形成的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,7 二硝基水杨酸试剂测定，麦芽糖能将3,5?二硝基水杨酸还原成硝基 氨基酸的显色基团，其颜色的深浅与精的含量成正比，故可求出麦 芽糖的含量。常用单位时间內生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性 的大小。 关键字：淀粉酶，活力测定 一、研究背景及目的： 酶大部分是由蛋白质构成，少数由核酸构成，能高效催化体新 陈代谢各步反应的催化剂，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化, 所以酶在生物中扮演着很重要的角色，对酶的测定研究也就具有了很 重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映了酶的催化能力，因此 测定酶的活力是研究酶的基秋。 淀粉酶是水解淀粉的糖昔键的一类酶的总称，按照其水解淀粉 的作用方式，可以分成a-淀粉酶，p—淀粉酶等。c(—淀粉酶和卩一淀 粉酶是其中最主要的两种。卩一淀粉酶存在于休眠的种子中，而a—淀 粉酶是在种子萌发过程中形成的，本实验的目的在于掌提这两种酶的 提取与测定方法。 二、 研究依据及原理： G—淀粉酶和卩一淀粉酶。［3—淀粉酶不耐高热，在高温下容易钝 化，而cc—淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。在萌发种子的提 取液中，这两种淀粉酶同时存在。本实验的设计利用这两种酶的不同 特性加以处理，钝化其一，即利用p—淀粉酶不耐热的特性，在高温 （70°C）下15min处理使得卩一淀粉酶钝化，从而测定（/—淀粉酶的活 性。而测定卩-淀粉酶时，可用pH 3.6的醋酸缓冲液处理提取液，以钝 化a—淀粉酶。 淀紛酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5--硝基水杨酸试剂测定, 由于麦芽糖能将后者还原成硝基氨基酸的显色基团，其颜色的深浅与 糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽 糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。 在实验中要严格控制温度及时间，以减少误差，并在酶的作用 过程中，四只测定管级空白管不用混淆。空臼管作为对照组消除非酶 反应带来的影响，以减少实验误差。 三、 实验材料与方法: 1、 实验材料：萌发的小麦种子（芽长1厘米左右） 2、 仪器： (1) 小台秤 (2) 研钵 (3) 容量瓶：50ml X 1,100ml XI (4) 具寒刻度试管：15mlX6 (5) 试管：8支 (6) 移液器 (7) 离心机 (8) 恒温水浴 (9) 分光光度计 3、 试剂： 1%淀粉溶液，称取1克可溶性淀紛，加入8()ml左力蒸馅水， 在电炉上加热溶解，等冷却后，定容到l()()ml pH5.6的柠檬缓冲液： A液：称取柠檬酸20.01克，溶解后定容到1升 B液：称取柠檬酸钠29.41克，溶解总定容到1升 取A液5.5毫升、E液14.5毫升混均，即为pH5.5柠檬酸缓冲液。 3,5-—硝基水杨酸溶液： 称取3,5-—硝基水杨酸1.()()克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入 5()ml蒸馆水，再加入3()克酒石酸钾钠，待溶解石，用蒸憎水稀释至 1()()“盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。 麦芽糖标准液： 称取麦芽糖()」()()克，溶于少量蒸憎水中，仔细移入10()“容量 瓶中，用蒸镐水定容到lOOmlo 0.4M NaOH 4、 操作步骤： (1)酶液的制备： 称取2克萌发的小麦种子，置于研钵中加少量石英砂研磨成匀浆，转 移到50ml容量瓶中，用蒸饱水定容到刻度，混均后在室温下放理， 每隔数分钟震荡一次，提取15-20分钟，离心，取出上清液备用。 a—淀粉酶活性的测定： 取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。 于每个管中各加入酶提取液1毫升，在7()°C恒温水浴中(水 浴温度的变化不应超过±().5°C)准备加热15分钟，在此期间卩 —淀粉酶钝化，取出后迅速在水浴中彻底冷却 在试管中各加入lmlpH5.6柠檬酸缓冲液 向两支对照管中各加入4ml().4MNa()H,以钝化酶的活性 将测定管和对照管置于4()°C ( ±0.5°C)恒温水浴中准确保 温15分钟，再向各管分别加入4()°C下预热的淀粉溶液2ml,摇 匀，立即放入4()°C水浴中准确保温5分钟石取出，向两支测定 管分别迅速加入4ml 0.4Na()H,以终止酶的活性，然后准备下 步糖的测定。 *及卩-淀粉酶总活性的测定： 取上述酶液5毫升，放入1()()凶 容量瓶中，用蒸镐水稀释至刻度(稀 释倍数是样胎酶活性的大小而定，一般为2()倍)。混均后，取4支试 管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1毫升及