基因工程II-外源基因的表达(ppt62)(1).pptxVIP

生物技术概论 基因工程 II外源基因的表达 生物技术学院王 萍概念 基因表达：生物在代谢活动和生长发育过程中将蕴藏在DNA的遗传信息传递到RNA分子，然后再转移到蛋白质分子的过程，即基因表达。 蓝藻表达系统大肠杆菌表达系统原核表达系统芽孢杆菌表达系统链霉菌表达系统基因表达系统酵母表达系统昆虫细胞表达系统真核表达系统植物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统授课内容（一） 外源基因在大肠杆菌中的表达 （二） 外源基因在酵母菌中的表达 （三） 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 参 考 书1、分子克隆实验指南 J．萨姆布鲁克，主编．金冬雁， 黎 孟枫，译．科学出版社.2、基因工程 楼士林，杨盛昌，龙敏南，等，主编. 科学出 版社. 3、基因工程原理 吴耐虎，主编. 科学出版社.（一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 1大肠杆菌受体细胞的特征 2外源基因高效表达的原理 3工程菌的构建策略 4遗传不稳定性及其对策 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达表达外源基因的优势 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 全基因组测序 基因克隆表达系统成熟完善被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物（一）外源基因在大肠杆菌中的表达劣 势 缺乏蛋白质的复性功能 缺乏蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解异源蛋白胞内含多种内毒素 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因高效表达的原理 启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数（一）外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因高效表达的原理 ◆ 启动子 定义：位于结构基因上游的一段与 DNA 依赖的 RNA聚合酶相结合的DNA序列，用P代表。 大小：为20－300bp。功能：转录目标基因的mRNA分类：组成型、调控型意义：在转录水平控制基因表达。 启动子 启动子-35 区序列-10 区序列 PλL T T G A C A G A T A C T PrecA T T G A T A T A T A A T Ptra A T A G A C A T A AT G T Ptrp T T G A C A T T A A C T Plac T T T A C A T A T A A T Ptac T T G A C A T A T A A T 乳糖启动子Plac的可控性：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 终止子 转录过头对外源基因表达的影响耗时耗能干扰复制，导致质粒的不稳定性不能形成理想的二级结构（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 核糖体结合位点 定义：位于启动子下游，从转录起始点开始 延伸几十个碱基长度的一段序列。 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 核糖体结合位点结构： SD序列（Shine-Dalgarno序列） 翻译起始密码子 SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5′ 端若干密码子的碱基序列（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 核糖体结合位点 对外源基因表达的影响： ● SD序列（Shine-Dalgarno序列）： 指位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5′UAAGGAGG 3′。 它通过与rRNA 16S亚基3′AUUCCUCC 5′端互补，并专一性结将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 核糖体结合位点 对外源基因表达的影响： ● SD序列与起始密码子之间的序列： ● SD序列与起始密码子之间的距离：（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 核糖体结合位点 对外源基因表达的影响： ● 翻译起始密码子： 位于核糖体结合位点的中心位置。 大肠杆菌翻译起始密码子： AUG、GUG或UUG。 策 略（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆ 密码子密码子偏爱性： 密码子偏爱性对外源基因表达的影响： 外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因 （一）外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式 包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达（一）外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达形式 ◆包涵体型表达 定义：大肠杆菌在表达一些异源基因时，在某些生长条件下，能将这些生物大分子致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹或无膜裸露结构，而不溶于水，这种结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达 组成：外源基因表达产物、外膜蛋白、载体蛋白及少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。 重组蛋白的性质：具有正确的氨基酸序列，但构象错误。（一）外源基因在大肠杆菌中的表达◆包涵体型表达优点： ●简化表达产物的分离操作 ●保