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基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 一.2 基因工程的基本操作程序 善假于物也 基因工程基本操作程序 提取目的基因， 目的基因与运载体结合， 将目的基因导入受体细胞， 目的基因的表达和检测 基因工程基本操作程序 一、 基因工程基本操作程序 获取目的基因的方法： 1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 基因工程基本操作程序 概念：基因文库 （gene library） 基因组文库 部分基因文库（如cDNA文库） 基因工程基本操作程序 基因组文库 cDNA文库 基因工程基本操作程序 基因组文库与部分基因文库的关系 基因工程基本操作程序 寻根问底—— （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 基因工程基本操作程序 （2）基因文库如何构建？ 将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶， 将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA 片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个 受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体 包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。 如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个 受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA 文库。 两种基因文库的主要区别如下表所示： 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 （3）如何从基因文库中得到所需要的基因？ 依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。 基因工程基本操作程序 2、利用PCR技术扩增目的基因 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 PCR技术原理 及反应过程 原理： DNA双链复制 反应过程： 1、加热至90～95 ℃ 目的基因DNA解链 2、冷却至55～60 ℃， 引物结合到互补DNA链 3、加热至70～75 ℃， 热稳定DNA聚合酶从 从引物起始互补链的 合成 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 二、基因表达载体的构建 1、基因表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因等 思考：作为基因工程表达载体， 只需含有目的基因就可以完成 任务吗？为什么？ 基因工程基本操作程序 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。 基因工程基本操作程序 寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。 2、构建目的 为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。 基因工程基本操作程序 三、将目的基因导入受体细胞 概念掌握——转化 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 将目的基因导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微