PCR的自动化和PCR产物积累规律——PCR反应条件优化（二） .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR的自动化和PCR产物积累规律——PCR反应条件优化（二） 一、PCR产物堆积逻辑 在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。在反应初期，目段的增强呈指数形式。随着目的DNA产物的逐渐堆积，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增强减慢，进入相对稳定状态，即浮现所谓的“停滞效应”，这种效应称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率及DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争等因素。普通在达到“停滞”阶段之前，用Klenow酶只能举行20次左右的循环，堆积大约3×105 个目的基因拷贝，而用丁Taq DNA聚合酶则可举行25次以上PCR循环，堆积4×108 个目的基因拷贝。这是由于Taq DNA聚合酶的高效及高特异性，削减来自非特异性延长产物对聚合酶的竞争，从而使在“停滞”期到达之前有更多的目的基因片段堆积。大多数状况下，平台期在PCR反应中是不行避开的。但普通在此之前，合成的目的基因片段的数量足可满足试验的需要。假如产量不够，可继续扩增，即将产物DNA样品稀释后作为模板，举行新一轮PCR反应。二、PCR的自动化在PCR技术发明的早期，因为用法的聚合酶(Klenow酶，T4 DNA聚合酶)耐热性差，每一个或数个循环后都需要重新加酶，反应只能在手工操作下举行。Taq DNA聚合酶的发觉使PCR的自动化成为可能。Cetus公司领先推出PCR自动扩增仪，产品不断革新，已实现了由电脑控制囫囵反应过程。目前，国内已有中科院遗传所、复旦高校、北京市应用新技术讨论所等多家单位推出的国产自动扩增仪。常用的PCR扩增仪主要有如下3种形式。①机械手 采纳机械手将样品在3个不同温度的水浴移动，举行PCR反应。此装置的优点在于温度转换快，耗时少(普通1～3h)，设备比较容易，简单控制和修理；缺点是温度升降太快，可能对聚合酶的活性有某些影响。②空气加热／光加热循环装置用热空气枪借空气作为热传扬媒介或用光照耀加热，由风扇提供外部冷空气，加上精确的温度传感器构成不同的温度循环。这种装置的优点是不用金属精密加工，成本低，囫囵系统没有液体流淌也不用制冷剂，因而平安程度高；缺点是整修试验控制温度变换耗时较长。③变温金属块作恒温装置 通过半导体加热和冷却，在一个铝合金金属块上来完成PCR过程。这种装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持聚合酶的活性，但相对来说温度变换梯度较小，囫囵试验耗时较长(3～4h)。上一篇：下一篇：