PCR方法对转基因大豆的筛选定性检测 .docxVIP

PAGE PAGE 1 PCR方法对转基因大豆的筛选定性检测 (二)试验原理PCR检测技术的基本原理是按照食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物，经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放入，最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无，从而对食品中是否含有靶标转基因序列成分举行判定。因为目前商品化的绝大多数转基因食品普遍含有CaMV 35S启动子，而CaMV 35S启动子的DNA序列早已藏匿。所以在对食品样品的转基因背景一窍不通的状况下，按照CaMV 35S启动子的DNA序列设计合适引物，通过PCR反应检测食品中是否含有CaMV 35S启动子基因序列，来判定该食品是否为转基因食品。(三)试验试剂和设备1．试剂CTAB提取缓冲液(pH 8.0)：称取4.00g CTAB, 16.38g，2.42g Tris, 1.50gEDTA二钠，4.00g PVP-40，用适量水溶解后，调整pH，定容至200mL，高压灭菌。临用前按用法量加入，使终浓度为2%;氯仿，异戊醇；70％；PCR反应试剂；核酸电泳相关试剂等。CaMV 35S启动子正向引物：5-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-3CaMV 35S启动子反向引物：5-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-32．仪器设备电子天平；15000r/min以上的台式离心机；离心管；移液器；恒温水浴锅；PCR仪；核酸电泳仪和电泳槽系统；核酸紫外观测仪或核酸凝胶成像系统。(四)试验办法和步骤1. CTAB法提取DNA称取100 mg样品加入2mL Eppendorf离心管中，加入700 uL CTAB缓冲液，涡旋振荡器混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2～3次。加入700uL的三氯甲烷-异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min，期间颠倒混匀离心管2～3次；12000×g离心5 min。转移上清液至1.5 mL Eppendorf离心管中，加入0.6倍体积经4℃预冷的，于-20℃下静置5 min, 12000×g离心5 min，当心弃去上清液。加入70％1000 uL，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下8000×g离心1 min，当心弃去上清液；加20 uL RNase A酶(10ug/mL)，37℃温育30min。加入600 uL溶液，65℃温浴10min。加入600 uL -Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000×g离心5min，转移上层水相至1.5 mL Eppendorf离心管中。加入0.6倍体积经4℃预冷的，颠倒混匀后，于4℃下静置30min ; 4℃下12000×g离心10min，当心弃去上清液。加入1000 uL经4℃预冷的70％，倾斜离心管，轻轻转动数圈后，4℃下12000×g离心10 min ,当心弃去上清液；用经4℃预冷的70％乙醇按相同办法重复洗一次。室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。加50uL TE缓冲液溶解DNA, 4℃保存备用。转移上清液时注重不要吸到沉淀、飘荡物和液面分界层。每个样品提取时应做2个提取重复。2. 基因组DNA的电泳分析取上述提取的基因组DNA 5 uL，加1 uL上样缓冲液，用0.8%琼脂糖凝胶举行电泳分析，以检查所提取的DNA是否完整。假如电泳后在凝胶图谱上只显示一条分子质量较大的DNA电泳条带，则解释提取DNA完整性好，可以满足试验要求；假如电泳后无显然的电泳条带，而只是在泳道展现含糊拖尾状DNA区段，则解释DNA已遭到降解破坏，不能应用于检测分析。3. PCR扩增反应(1) PCR反应体系PCR反应的总体积为25 uL，可以在不转变试剂浓度的状况下，适当扩大反应体系(如表5-8所示)。表5-8 PCR反应体系注：如PCR缓冲液中已经含有，则在反应混合液的终浓度应调节为1.5mmo/L。(2) PCR对比PCR试剂对比(即不含DNA模板的PCR扩增反应液试剂)；阴性目标DNA对比：不含外源目标核酸序列片段的模板。可用法阴性标准物质，并与测试样品等同处理举行核酸提取及PCR扩增。(3) PCR反应参数用法不同的PCR仪，可对参数作适当地调节(如表5-9所示)。表5-9 PCR反应参数4．确证通过限制性内切酶酶切反应鉴定PCR产物，用限制性内切酶Xmn I酶切PCR产物产生115bp和80bp两个片段。5．结果推断假如具备下列条件，就能确定检测到目标序列：PCR扩增产生195 bp的DNA片段；经过序列分析，未知样品PCR扩增条带的DNA序列与阳性对比DNA序列全都；用限制性内切酶Xmn I酶切PCR产物产生预计大小的片段；经过实时荧光PCR办法确证。