贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达.doc

贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达 【摘要】 目的： 实现贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like protease, Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达，验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-like protease基因家族成员。方法： (1)提取贵阳腐霉总RNA，以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术扩增Pr1基因ORF片段；(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP，转化表达菌株E.coli ER2566，IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果： 成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP，实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论： 证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。 【关键词】 灭蚊； 枯草杆菌蛋白酶类； 逆转录聚合酶链反应； 基因，真菌； 贵阳腐霉； 类枯草菌素蛋白酶； 原核表达 ［Abstract］ Objective: To verify if a DNA fragment we obtained from Pythium guiyangense Su before is the ORF of a subtilisin-like protease (Pr1) of P. guiyangense, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: A prokaryotic expression system was established: The total RNA of P. guiyangense was extracted at the time point of most abundant expression of Pr1, and cDNA was obtained with reverse transcription PCR. The subject sequence was cloned. A plasmid pTWIN1-Pr1-EGFP containing the sequence as well as an EGFP gene was constructed, and transformed into ER2566 cells. The gene expression was observed after IPTG induction. Results: Green fluorescence protein expressed and Pr1 activity increased in ER2566 cells after the transformation. Conclusions: Its proved that the DNA fragment is really ORF of a Pr1 gene of P. guiyangense, and that the method for verification of cloned gene is efficient. ［Key words］ mosguito control; subtilisins; reverse transcriptase polymerase chain reaction; genes,fungal; Pythium guiyangense Su; subtilisin-like protease; prokaryotic expression 贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)是由贵阳医学院苏晓庆教授分离得到的一株具有自主知识产权的可以高效地、特异地杀灭蚊幼虫的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径［1］。通过研究发现，与其它昆虫病原真菌一样，P. guiyangense菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶（Pr1、Pr2蛋白酶）、几丁质酶和脂酶等水解酶。尤其是Pr1蛋白酶能降解昆虫体壁，在贵阳腐霉侵入孑孓体内过程中应该起重要作用，是贵阳腐霉等昆虫病原菌重要的毒力因子［2］。为了采用基因工程培育贵阳腐霉优良菌株，对该菌的胞外蛋白酶进行研究，并于2004年克隆了一长1 519 bp 的疑是Pr1蛋白酶的DNA片段(YP1977)，为了进行验证，构建了Pr1-EGFP融合基因，再将该融合基因转化大肠杆菌，对其中Pr1蛋白酶的表达进行观察。 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒 贵阳腐霉由贵阳医学院生物防治课题组保存。E.coli ER2566、