分子生物学实验1sds法提取植物基因组.pptx

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实验一 SDS法提取植物核酸;了解SDS法提取植物组织总核酸的原理 掌握提取植物组织总核酸的方法;核酸包括DNA和RNA两种分子,在细胞中都是与蛋白结合的状态存在。 细胞质中含有少量的DNA,分布在线粒体和叶绿体内。 植物细胞内的各种DNA总称为总DNA。 ;一切生物的遗传物质——核酸;实验原理; 提取和纯化DNA,首先需破碎或溶解细胞,用高盐(1mol/L NaCl)将DNP抽提出来,再把蛋白质、多糖、RNA及无机离子除去。;SDS(十二烷基硫酸钠)法 SDS使细胞膜裂解,使蛋白质变性,将蛋白质和多糖等杂质与DNA分开, 加入乙酸钾可使SDS-蛋白复合物转变成溶解度更小的钾盐,使沉淀更加完全。 CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)法 可溶解细胞膜,在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)与DNA结合形成复合物并呈溶解状态,但当浓度降低到一定程度(0.3mol/L NaCl)时,DNA即从溶液中沉淀,通过离心可将DNA-CTAB复合物与多糖与蛋白质分开。 ;材料 新鲜小青菜。 仪器用品 1.用具 玻棒、烧杯(250毫升)、量筒(100毫升)、分析天平; 研钵、离心管、 37OC水浴、离心机等。 2.药品配制 (1)研磨缓冲液(pH7.0):分别称取一定量的NaCl、柠檬酸三钠和EDTA三种药品,定容于1000毫升蒸馏水中(0.45mol/LNaCl,0.045mol/L柠檬酸三钠,0.1mol/LEDTA)(3×SSC),再在定容好的溶液中按1%比例加入SDS,调pH到7.0。 (2)氯仿-异戊醇:按照氯仿:异戊醇=24:1比例配制。 (3)溶解DNA溶液(pH7.0):即0.1×SSC 溶液,含有0.015mol/LNaCl,0.0015mol/L柠檬酸三钠。 (4)95%或100%乙醇(4?C冰箱预冷)。 ;NaCl:破坏核酸-蛋白质间的静电引力,使氢键破坏,核蛋白解聚; EDTA:破坏细胞膜、螯合Mg2+ ,使DNase失活; SDS:破坏细胞膜、抑制核酸酶,还可使核酸从蛋白质上游离出来。 酚/氯仿:混合使用能增加去除蛋白的效果,并对核酸酶有抑制作用。同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 ;称新鲜嫩叶1克,放在研钵内,加入与2-3ml体积的研磨缓冲液,充分将植物组织研磨成为浆状物。 将600ul浆状物加入一个1.5ml离心管内,60?C水浴裂解30分钟,期间颠倒混匀2次。 加入等体积(600ul)的氯仿—异戊醇??合液,盖上管盖,剧烈摇晃30秒钟,以脱除组织蛋白质。 离心管平衡后,10000转/分,离心5min,形成三层,小心的吸取上层含核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 取0.5ml溶液转入1.5ml离心管,加2倍体积95%或100%预冷乙醇溶液,12000转/分,离心5min,将核酸沉淀出来,溶于适量0.1*SSC中,以待纯化使用。 ;称新鲜嫩叶1克,放在研钵内,加入与2-3ml体积的研磨缓冲液,充分将植物组织研磨成为浆状物。 ;离心管平衡后,10000转/分,离心5min,形成三层,小心的吸取上层含核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 ;取0.5ml溶液转入1.5ml离心管,加2倍体积95%或100%预冷乙醇溶液,12000转/分,离心5min,将核酸沉淀出来,溶于适量0.1*SSC中,以待纯化使用。 ;实验结果;称新鲜嫩叶1克,放在研钵内,加入与2-3ml体积的研磨缓冲液,充分将植物组织研磨成为浆状物。 将600ul浆状物加入一个1.5ml离心管内,60?C水浴裂解30分钟,期间颠倒混匀2次。 加入等体积(600ul)的氯仿—异戊醇混合液,盖上管盖,剧烈摇晃30秒钟,以脱除组织蛋白质。 离心管平衡后,10000转/分,离心5min,形成三层,小心的吸取上层含核酸的水溶液,弃去中间的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。 取0.5ml溶液转入1.5ml离心管,加2倍体积95%或100%预冷乙醇溶液,12000转/分,离心5min,将核酸沉淀出来,溶于适量0.1*SSC中,以待纯化使用。 ;移液枪的使用:量程 离心机的使用:平衡,转速; 1. 在本实验中所用SDS在提取核酸过程中有何作用? 2. 在上清液中加入95%(或100%)乙醇后,你看到出现的核酸是什么状态?

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158****9376
该用户很懒,什么也没介绍

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