荷瘤小鼠T细胞表面CD59分子的表达与T细胞信号转导的相关性研究.doc

荷瘤小鼠T细胞表面CD59分子的表达与T细胞信号转导的相关性研究 【关键词】 荷瘤小鼠T细胞　CD59分子　T细胞信号 　　CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidy inositol, GPI)锚着于细胞膜表面的糖蛋白, 广泛分布于造血细胞、 非造血细胞及多种组织细胞表面, 其主要功能是调节补体活化, 通过与补体攻膜复合物（membrane attack complex, MAC）装配过程中的C8 和/或C9 结合从而抑制补体的活化［1］。有许多研究证实, CD59也参与T细胞的黏附及细胞信号的转导［2］。荷瘤机体的T细胞往往出现活化信号转导异常, 导致其功能低下, 甚至处于无反应状态［3］。最近有学者研究发现CD59在肿瘤患者的红细胞上的表达明显降低, 导致天然免疫的失衡［4］。但对于荷瘤机体内T细胞CD59的表达情况及对T细胞活化的影响, 尚未见报道。本研究将通过建立小鼠HeLa细胞肿瘤模型, 对荷瘤机体T细胞的CD59表达情况及对T细胞活化的影响进行探讨。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 HeLa细胞致瘤模型小鼠由本课题组前期建立; 淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司; 纯化的CD59单克隆抗体（mAb）为BD Biosciences的产品; 荧光探针Fluo3/AM购自Biotium, HEPES(Solarbio); FITC标记山羊抗小鼠IgG(HL)为中杉金桥公司产品, FITC标记的抗小鼠CD25和PE标记的抗小鼠CD4均购自Biolegend公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞制备 取前期HeLa细胞致瘤的小鼠和正常对照小鼠, 无菌分离两组小鼠胸腺, 制备单细胞悬液, 淋巴细胞分层液获取单个核细胞, 再经尼龙柱处理获取T淋巴细胞, 苔盼蓝染色细胞活率95%以上。调整细胞密度为4×108/L, 加入100 mL/L胎牛血清, 青霉素、 链霉素各100 mL/L的RPMI1640培养液10 mL, 50 mL/L CO2 、 37℃培养箱培养。 　　1.2.2 T细胞表面CD59表达 取1 mL两组T细胞, PBS洗3遍, 滴于载玻片上吹干, 950 mL/L乙醇固定5 min, 吹干; 加CD59mAb(1∶640), 10 μL, 对照加IgG2a, 10 μL, 37℃湿盒孵育45 min, PBS洗3遍, 5 min/次, 吹干; 加FITC标记的山羊抗小鼠IgG(HL)（1∶320）, 10 μL, 37℃湿盒孵育45 min, PBS洗3遍, 5 min/次, 吹干; 荧光显微镜观察。荧光的检测及结果判定: 随机选取5个视野, 根据特异荧光强弱依次用弱阳性（±）、 阳性（+）、 强阳性（）表示, 无特异性荧光的用阴性（-）表示, 并根据荧光强度记分: 阴性为0分, 弱阳性为1分, 阳性为2分, 强阳性为3分。 　　1.2.3 细胞内Ca2+的测定 (1)Fluo3/AM负载细胞: 取前期准备的小鼠淋巴细胞, 经苔盼蓝染色细胞活率95％以上, 调整细胞密度为5×109/L, HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍, 加10 μmol/L Fluo3/AM , 100 μL, 37℃孵育40 min。孵育后, 1 000 r/min, 离心10 min, 吸弃Fluo3/AM上清, HEPES缓冲液（pH7.4）洗3遍。加0.5 mL HEPES缓冲液, 待检。(2) T细胞内Ca2+的测定: 使用Nikon激光共聚焦显微镜检测细胞内的Ca2+, 按文献方法［5］检测。结果以未加处理因素前的荧光值为100%。 　　1.2.4 流式细胞术检测T淋巴细胞CD25表达 T细胞中加入1 mg/L CD59mAb, 37℃孵育48 h。调整细胞密度2×108/L, 吸取250 μL不同组细胞悬液平均分放1、 2、 3号EP管中, 设置对照组和同型对照组, 加入FITC标记的抗小鼠CD25, PE标记的抗小鼠CD4, 各10 μL, 混匀后, 4℃避光作用30 min, 50 g/L白蛋白PBS洗2次, 5 min/次。多聚甲醛固定, 避光保存, 24 h内流式细胞仪进行分析。 　　1.2.5 统计学分析 所有数据以x±s, 两样本比较采用双样本t检验, 全部统计处理均在SPSS10.0软件上进行。 　　2 结果 　　2.1 T细胞CD59表达 分别观察对照组和实验组T细胞表面CD59特异荧光的表达, 实验组荧光表达明显减弱, 差别有统计学意义（Plt;0.05, 表1）。 　　表1 两组T细胞CD59表达的比较（略） 　　2.2 CD59mAb对两组T细胞［Ca2+］i的影响 加入CD59mAb后, 静息T细胞中［Ca2+］i明显升高, 1