结缔组织核心蛋白聚糖基因在结肠癌组织中转录水平表达的研究.doc

结缔组织核心蛋白聚糖基因在结肠癌组织中转录水平表达的研究 作者：宋操 海萍 高申 张桂珍 【摘要】 目的:观察Decorin mRNA在结肠癌组织中的表达，探讨Decorin表达与结肠癌的关系。方法:临床手术切除新鲜结肠癌组织石蜡切片，应用原为杂交技术检测Decorin基因转录水平的表达。结果:结肠癌组织中与相对正常结肠组织中均可见Decorin mRNA表达，但两者之间的表达未见统计学差异（Pgt;0.05）。结论:探索Decorin转录水平表达与结肠癌发生发展的关系，只应建立在大样本观察基础上进一步作深入的研究。 【关键词】 核心蛋白聚糖（Decorin）;结肠癌;原位杂交 　　为了探讨结缔组织核心蛋白聚糖（Decorin）与大肠癌发生发展的关系，本研究选择临床手术切除的新鲜结、直肠癌组织标本，应用原位杂交与从基因转录水平研究了Decorin在大肠癌组织中的表达。 　　1 材料与方法 　　1.1 临床资料 　　2003年3月～8月间吉林大学中日联谊医院手术切除结直肠癌标本10例，其中男性6例，女性4例，年龄37～64岁，平均年龄51.2岁。手术后病理组织类型为管状腺癌8例，乳头状腺癌2例。分化程度中、高分化腺癌7例，低、未分化腺癌3例。按Dukes分期A级1例，B级7例，C级2例。手术切除远离结直肠癌的相对正常大肠组织标本9例，迅速固定4%多聚甲醛24hr，石蜡包埋。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 原位杂交方法 　　原位杂交探针针对人Decorin靶基因的mRNA序列为:（1）5-ATGGA AATCA GA-CAG TACCT GGCAC AGTGG-3;（2）5-AAGTT GAGAC TGTTG GTGAA ATTGC AAGAG-3;（3）5-CCTTC TAGAC TTCAG ACCAC AGACA ACCTG-3。 杂交程序:石蜡包埋切片厚度4μm，58℃烤片30min，常规脱蜡至水;3%H2 O2 灭活内源性过氧化物酶，室温10min，DEPC水洗3次;切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化20min;原位杂交PBS洗5min×3次，DEPC水洗涤1次;1%多聚甲醛.0.1M PBS，含有1.1000DEPC后固定，室温10min，DEPC水洗3次;预杂交恒温38℃，2hr;恒温箱38℃杂交过夜。37℃2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次，37℃0.2×SSC洗涤15min×2次;滴加封闭液，37℃30min;滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃60min，PBS洗5min×4次;滴加SABC，37℃20min，PBS洗5min×3次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃20min，PBS洗5min×4次;DAB显色20min，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明封片。 　　1.2.2 原位杂交结果判定标准 　　参照Fromowitz方法［1］，Decorin蛋白表达以细胞核或细胞胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。随机观察5个中倍镜下视野，每个视野计数100个细胞，算出各个视野中阳性细胞数的平均百分比进行计分。0%～5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，大于75%计为4分;染色强度则以阳性细胞呈现的染色特征为标准进行计分:细胞未染色计为0分，染色呈淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分;然后根据两者相加所得的总分进行结果判定。0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（），6～7分为强阳性（）。 　　1.2.3 统计分析 　　SAS8.0统计软件进行Fisher精确概率计算及t检验。 　　2 结果 　　Decorin mRNA在结直肠癌中的表达，结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内均可见Decorin mRNA表达（图略）。其中相对正常大肠腺细胞Decorin mR-NA表达阳性率为100%，以胞核表达为主，胞核表达阳性率为66.67%，胞浆表达阳性率为33.33%。而结直肠癌癌细胞Decorin mRNA表达阳性率为60%（6/10），且均为胞浆表达。结直肠癌及相对正常大肠腺细胞Decorin mRNA阳性信号染色强度均较弱。虽然Decorin mRNA在相对正常大肠中表达阳性率高于结直肠癌，但其差别无显著性（Pgt;0.05）。见表1。 表1 Decorin mRNA在结直肠癌及相对正常大肠中的表达 组 织 n 总阳性（%） 阳 性 分 型胞核（%）胞浆（%）相对正常大肠 9 9（100） 6（66.67）3（33.33）结直肠癌 10 6（60） 0（0） 6（60）P值 gt;0.05 　　3 讨论 　　本实验结直肠癌两种肿瘤组织中Decorin表