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第八章 蛋白质和氨基酸的测定;第八章 蛋白质和氨基酸的测定;第一节 概述 ;第一节 概述——蛋白质和氨基酸的概念;第一节 概述——蛋白质和氨基酸的概念;第一节 概述——蛋白质和氨基酸的概念;第一节 概述——蛋白质和氨基酸的概念;第一节 概述——关于蛋白质的换算系数;第一节 概述——蛋白质和氨基酸的概念;第一节 概述——蛋白质的测定方法;第二节 蛋白质的定性测定 ;第二节 蛋白质的定性测定;第二节 蛋白质的定性测定;第二节 蛋白质的定性测定;第二节 蛋白质的定性测定;第三节 蛋白质的定量测定;第三节 蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法;常量、半微量以及微量定氮法它们的原理相同，都要经过消化、蒸馏、吸收、滴定步骤： 消化 样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。 单纯的浓硫酸沸点较低，消化反应比较慢，且容易造成消化不完全，如何解决这个问题呢？ 溶液中加入适当的无机盐，可提高沸点，因此可采用加无机盐等方法。;通常消化过程中添加K2SO4，它与硫酸反应生成KHSO4，可以提高温度至400℃，加快有机物分解(一般纯H2SO4加热沸点330℃)。也可以加入Na2SO4 盐类来提高沸点。另外，随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大,为什么??? 易造成温度过高，生成的硫酸氢铵分解，放出氨而造成损失。;为了加速反应过程，还加入CuSO4 ，HgO或Se粉等，起什么作用???? 作为催化剂，降低反应能垒，加速反应进程； 消化过程通常也加入少量H2O2，KClO，起什么作用?? 作为强氧化剂，增强体系氧化性，加速氧化降解反应。 为防止污染常用CuSO4，除催化作用，还有什么作用？ 消化完全的指示作用。为什么可作指示剂？ 反应完成后催化过程中的一价铜离子，恢复为二价铜离子(硫酸铜) ，呈兰绿色;蒸馏 样液中的(NH4)2SO4在碱性条件下释放出NH3。 (NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + H2O + NH3↑ 测定是以碱性、挥发性大的NH3为定量标准，那么在操作中需要注意些什么呢？ 加入NaOH溶液要过量，保证NH3全部释放出； 防止样液中NH3气逸出。 吸收与滴定 蒸馏过程中放出的NH3可用一定量的标准硼酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准硫酸或盐酸标准溶液滴定，从而计算出总氮量;凯氏定氮法——反应过程;???确称取样品0.50-2.00g(半固体2-5g，液体10-20mL)→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml 浓H2SO4→通风橱中先以小火加热→泡沫消失后→加大火力→消化至透明无黑粒→摇动瓶子?? 使瓶壁炭粒溶于硫酸中 →继续消化30分钟→至到样液呈透明绿色状态？ 二价铜离子的颜色(CuSO4) →停止消化→冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波璃珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时(200-250mL)，取出用水冲洗→用0.1mol/L HCl滴定(终点:蓝色→微红) 注意：要做空白实验。;第三节 蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法;滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积;所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全造成氮损失。 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口再蒸1分钟后关掉热源。为何如此做?? 避免造成吸收液倒吸。;说明及注意事项;如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸被过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。 氨是否完全蒸馏出来，如何检验?? pH试纸检查馏出液是否为碱性。 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀,为什么？。 分解促进剂(碱)与硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的 络合物。 消化剂变绿色后继续消化30分钟即可。;微量凯氏定氮法与常量凯氏定氮法的区别：;第三节 蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法;3. 自动凯氏定氮法;3. 自动凯氏定氮法;第三节 蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法;第三节 蛋白质定量测定——（1）凯氏定氮法;第三节 蛋白质定量测