抗细菌转基因工程课程资料 .pptx

抗细菌转基因工程课程;病菌特点;水稻细条病的发病特点;Rxo1 基因来源;Rxo1 基因定位;基因Rxo1 的双右边界双元载体的构建; (1)美国Kansas州立大学的Scot H、 Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1质粒,其中 携带有外源目的基因Rxol;; (2)澳大利亚CSIRO Plant Industry的M Upadhyaha博士提供双右边界双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农杆菌中进行后续转基因:;1、2双右边界双元载体的构建;质粒pCAMBIA1305-1-Rxol经内切酶Sac I和NgoM IV酶切,得到大小为8、Skb的Rxol目的基因片断(图A ),载体pMNDRBBin6经Hpa I和Xma I酶切,得到大小为12、3kb的线性化双右边界载体(图B ) ;(2)阳性克隆筛选 将过夜连接产物转化大肠杆菌,在LB固体培养基(含SOmg/L壮观霉素)上涂布37℃培养,挑取转化子单克隆于LB培养基(含SOmg几壮观霉素)中振荡培养Sh;提取转化子质粒进行扩增,使用引物Rxol-F (5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R (5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’ )筛选获得阳性克隆;筛选出1个转化子,其特异性扩增片段与1、45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取该克隆质粒DNA进行PCR扩增,扩增片段大小与阳性对比pCAMBIA1305-1-Rxol相同,将产物回收纯化连接到pMD20-T上测序,与目的基因序列比对相同,表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6载体中。 ; 1 M 2 3 4; (2)对整合了Rxol基因的pMNDRBBin6载体使用Hpa I和Xma I进行双酶切,应得到大小为20、875kb的片段。该阳性克隆的质粒经酶切后产生1条带约为20kb(图2、5 ),与目的基因片段和pMNDRBBin6载体的长度之和相等记为pMNDRBBin6-Rxol a;(3) pMNDRBBin6-Rxol经EcoR I酶切后产生4个片段,大小分别为9378bp, 8576bp, 1632bp和1268bp (9378bp和8576bp片段长度相近,图中合为一条粗带)(图2、6A); Sac I酶切产生5个片段,大小分别为8525bp, 5194bp, 2683bp, 1763bp和1528bp(图2、6B ) ;(3)阳性克隆酶切鉴定和PCR扩增 (4)载体序列分析 (5)保存阳性克隆,以备后续遗传转化工作。 ;水稻的遗传转化;(2) 农杆菌活化;(3) 侵染、共培养与筛选;(4) 植株再生;(5) 生根培养;(6) 壮苗与炼苗;(7) 转基因后代的表型检测与分子检测;基因检测; 细菌性条斑病菌株的分离培养与接种鉴定;; 转基因植株的表型鉴定和分子鉴定; 转基因植??的抗病反应 接种后 12 小时的 9804-Rxo1 和 9804 植株在接种点没有可见的表型差异;在空气湿度较高的环境下,接种后 24 小时(24hpi, hours post inoculation)可在非转基因受体 9804 的接种点周围观察到水浸状斑点,而在转基因植株的叶片接种点周围无明显症状;接种后 36小时及 72 小时的受体 9804 病斑依次成条扩展,而转基因植株的接种位点周围由白变浅褐色,HR症状逐渐明显;在接种后 96 小时明显可见细菌病害的典型病症—菌脓,在接种后 132 小时菌脓则布满接种点周围叶片;在转基因植株的接种点则出现明显的 HR 表型,接种点周围小范围内植物细胞坏死、变褐、限制细菌在维管束中的扩展,呈现明显的抗病反应。;;感谢您的聆听！