RealtimePCR溶解曲线分析.pdfVIP

首先我们得来说说染料法 SYBR Green 的原理， SYBR Green 能够结合在双链 DNA 上面的荧光染料，只有结合了双链 DNA ，才会发荧光，而游离的不会发光。 图 1 SYBR Green 原理 但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链 DNA ，就会染上，并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增， 那么荧光强度就不是目的条带真实的强度， 因此会产生严重偏差。融解曲线 我们如何判断本次 qPCR 扩增的都是目的片段 呢？这就需要用到融解曲线。 在 qPCR 循环反应结束之后，系统会进行测定融 解曲线，通常的方式就是从 70 度加热到 90 度，然后每隔一定时间（ 1s 或者少 于 1s）测定系统荧光强度， 随着温度的升高， dsDNA 都解开双链， SYBR Green 都游离之后不发荧光， 荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线： 图 2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的 高等数学 C 的求导，把荧光强度对温度求导，得出 下图 图 3 融解曲线的求导 为什么中间的峰那么高？ dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升， 达到图中 Tm 点时，大部分扩增出来的双链 DNA 解开，荧光值下降非常快。如 果 qPCR 产物非常特异那么，融解曲线在 80-90 之间会形成一个单峰 (温度和 qPCR 产物长度以及 GC 含量相关 )。 但是除了单峰还会出现什么样的情况呢？ 请看下面两个示意图 图 4 前置杂峰 图 5 后置杂峰