细胞工程实用.pptxVIP

会计学;Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。;生物种类;植物融合细胞成长状态对比,右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞 ;动物细胞融合实验使用的小白鼠 ;三、动植物细胞的融合过程;四、细胞融合的意义;第二节 细胞融合的基本原理;显微镜下细胞融合过程;融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 ;第三节 细胞融合的常用方法;一、仙台病毒法;病毒促使细胞融合的主要步骤如下：;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图 ; 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。 聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作细胞融合剂。 PEG浓度以W/W；如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培养液为1g重)，即成50％PEG溶液。 PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好，50％PEG溶液能产生 最多杂交细胞。 PEG溶液在pH6.0时细胞融合率最高。;聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程;PEG的作用机理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 ;聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。;第20页/共49页;三、电融合法;电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 ;电融合诱导法原理示意图;第三节 杂种细胞的筛选;基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选;第四节 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体;一、何谓单克隆抗体？;第28页/共49页;第29页/共49页;第30页/共49页;只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。; 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myeloma cell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridoma cell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology ）。;Niels K. Jerne ;二、杂交瘤技术的基本原理;三、杂交瘤细胞的制备; ;;（三）脾细胞的制备;;（五）细胞融合;（六）融合后细胞培养; ;（七）抗体检测;（八）单克隆抗体的大量制备;四、单克隆抗体的应用;第五节 人源单克隆抗体;第47页/共49页;本章小结;感谢您的观看！