第三章酶的分离与纯化.pptVIP

Size-exclusion chromatography 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 上节课主要内容 酶分离纯化的方法 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 复合沉淀法 选择性变性沉淀法 差速离心 密度梯度离心 等密度梯度离心 粗滤 微滤 超滤 纳滤 反渗透 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦 凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示： Ve-Vo Kd=———— Vi Vo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml） Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml） Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml） 凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰 Ⅰ. Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。 Ⅱ. Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。 Ⅲ. 其它组分0Kd1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。 Ve-Vo Kd=———— Vi 分配系数Kd的意义： 1) 可定量地衡量各组分的流出顺序。 2) 判断分离效果，Kd差异大，分离效果好， Kd差异小，分离效果差。 常用的凝胶： 葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 凝胶型号 颗粒大小/μm 溶胀体积/(ml/g) 分离范围（Mr） Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 4～120 4～120 50～150 50～150 40～120 40～120 40～120 40～120 2～3 2.5～3.5 4～6 9～11 12～15 15～20 20～30 20～30 小于7×102 小于1.5×103 1.0×103～5.0×103 1.5×103～3.0×104 3.0×103～8.0×104 4.0×103～1.0×105 5.0×103～3.0×105 5.0×103～6.0×105 型号 使用范围（蛋白质的分子量） 含琼脂糖（℅） ? 6B Sepharose 4B 2B 104～3×106 105～3×107 106～108 6 4 2 ? 6B Sepharose CL 4B 2B ? 同上 同上 ? 0.5m ?Bio-Gel A 1.5m 5m 15m 50m 150m 10～500×103 10～1500 10～5000 40～15000 100～50000 1000～150000 10 8 6 4 2 1 类型 说明 功能基 反离子 DEAE-Sephadex A-25 ，A-50 弱碱性阴离子交换剂 二乙氨基己基 氯 QAE-Sephadex A-25 ，A-50 强碱性阴离子交换剂 二乙氨基己基——2-羟丙基 氯 CM-Sephadex C-25 ，C-50 弱酸性阳离子交换剂 羧甲基 钠 SP-Sephadex C-25 ，C-50 强酸性阳离子交换剂 磺丙基 钠 离子交换葡聚糖 （5）选择性变性沉淀法 定义：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。 方法： ① 热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。 ② pH变性 等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。 ③有机溶剂变性 使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。 2、离心分离 离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质