流感禽流感实验室诊断及新技术新进展讲课文档.pptVIP

荧光PCR结果－阳性样品 现在三十页，总共七十九页。 荧光PCR结果－阴性样品 现在三十一页，总共七十九页。 荧光PCR结果－可疑样品 现在三十二页，总共七十九页。 病毒分离-MDCK细胞 标本接种MDCK细胞 每日观察细胞病变(CPE) MDCK细胞收获 33－35℃培养 现在三十三页，总共七十九页。 接种流程 清洗MDCK 细胞 临床采样标本接种细胞 Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍 33－35度吸附1－2小时 Hank’s液清洗细胞 加入病毒生长液，33－35度培养箱培养 24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获 （细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落 ） 根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本 流程图 现在三十四页，总共七十九页。 MDCK细胞病毒分离 CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关 每日观察细胞病变(CPE) 标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，标本可弃去 现在三十五页，总共七十九页。 细胞病变图 现在三十六页，总共七十九页。 鸡胚病毒分离 标本接种于9日龄鸡胚 33℃～35℃培养72小时 检卵 标本准备 现在三十七页，总共七十九页。 现在三十八页，总共七十九页。 鸡胚分离方法-试剂准备 1)????? 9～11日龄鸡胚 2)????? 照蛋灯 3)????? 70%～75％酒精 4)????? 1ml 一次性注射器 5)????? 鸡蛋开孔器 6)????? 无菌胶布或蜡 7)????? 10ml 试管和试管架 8)????? 10ml 移液管或1ml移液器及无菌吸尖 9)????? 无菌镊子 10) 无菌眼科剪 现在三十九页，总共七十九页。 鸡胚分离方法-标记鸡胚 ■ 检视标记鸡胚 ◆ 用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 ◆ 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置 ◆ 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉 现在四十页，总共七十九页。 ■ 接种病毒方法 ◆ 单腔接种 盲种 ◆双腔接种 灯下接种 开窗接种 鸡胚分离方法 现在四十一页，总共七十九页。 鸡胚分离流程（1） ◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚 ◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口 ◆用注射器吸200μl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μl标本。将针头退出至? 寸，将另外100 μl标本 注入鸡胚尿囊腔 现在四十二页，总共七十九页。 鸡胚分离流程（2） ◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚 ◆将针头弃于合适的生物安全装置中 ◆用消毒过的医用胶布封口 ◆ 33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天 鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去 现在四十三页，总共七十九页。 鸡胚分离流程（3） ■收获尿囊液和羊水 ■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时 ■标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致 ■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部 ■用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml 吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并 现在四十四页，总共七十九页。 鸡胚病毒鉴定 经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去 鸡胚收获 HA试验 现在四十五页，总共七十