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（2）包埋法 将载体（聚合物等）与生物分子溶液混合，借助物理作用，生物分子被包埋在载体中以达到固定化。包埋法操作简单，由于生物分子只被包埋，未发生化学反应，可得高活力的固定化生物蛋白。对大多数生物分子甚至完整的微生物细胞都适用。 第55页，共90页，编辑于2022年，星期五 包埋法包括凝胶包埋法和微囊化包埋法： 凝胶包埋法（胶格包埋法）：将生物分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋法 ：丙烯酰胺单体、交联剂和蛋白混合，然后加入催化剂使之开始聚合，结果就在生物分子周围形成交联的高聚物网络。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的蛋白回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 明胶、壳聚糖等也是常用的包埋载体。 第56页，共90页，编辑于2022年，星期五 微囊化包埋法：将生物分子包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使蛋白存在于类似细胞内的环境中，从而增加了生物分子的稳定性。 界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将蛋白包埋。 界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些生物分子还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。 表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。 第57页，共90页，编辑于2022年，星期五 包埋法的优点：是一种反应条件温和、很少改变生物蛋白结构但是又较牢固的固定化方法。 包埋法的缺点：只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的生物蛋白并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化生物分子动力学行为改变，使活力降低。 包埋法的优缺点 第58页，共90页，编辑于2022年，星期五 （3）共价结合（偶联）法 生物蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将生物分子固定在支持物上（借助共价键将生物蛋白的非活性侧链基团和载体的功能基团进行偶联）。 第59页，共90页，编辑于2022年，星期五 共价偶联法操作原则：（ a ）载体的物化性质要求载体亲水，并且有一定的机械强度和稳定性，同时具备在温和条件下与生物分子结合的功能基团。（ b ）偶联反应的反应条件必须在温和pH、中等离子强度和低温的缓冲溶液中。（ c ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对蛋白的其它功能基团副反应尽可能少。（ d ）要考虑到蛋白固定化后的构型，尽量减少载体的空间位阻对蛋白活力的影响。 第60页，共90页，编辑于2022年，星期五 生物蛋白可提供的与载体连接的功能基团： ①蛋白N—端的氨基； ②蛋白C-端的羧基以及Asp残基的α-羧基和Glu残基γ-羧基； ③Cys残基的巯基； ④Ser、Tyr、Thr残基的羟基； ⑤Phe和Tyr残基的苯环； ⑥His残基的咪唑基； ⑦Trp残基的吲哚基。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基、苯环。被偶联的基团还应是生物分子活性的非必需基团，否则将导致生物蛋白失活。 第61页，共90页，编辑于2022年，星期五 共价偶联法载体的选择的一般要求: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化生物分子活力及其稳定性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须有在温和条件与生物蛋白共价结合的功能基团。 ④载体没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易，能反复使用。 第62页，共90页，编辑于2022年，星期五 偶联反应： 缩合反应：一些带羧基或氨基的载体用碳化二亚胺活化后，与生物蛋白分子的氨基或羧基直接偶联。 酸酐反应 ：在己二胺作用下，酸酐与生物蛋白的氨基起偶联反应。 重氮反应：将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再与生物蛋白发生偶联。 异硫氰酸反应：含有芳香氨基的载体，与光气反应生成异硫氰酸，再与酶分子的氨基连接。 活化酯法：含羧基的载体在二环己基碳二亚胺存在下用N—羟基琥珀酰亚胺活化，再连接生物蛋白。 酰氯化反应：含羧基载体，用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，再与蛋白的氨基偶联。 第63页，共90页，编辑于2022年，星期五 三、离子传感器的响应机理 溶液中的离子与敏感膜上的离子之间发生交换作用 敏感膜内外离子活度差 敏感膜内外产生电位差 膜电位?M 对于阳离子： 对于阴离子： 第23页，共90页，编辑于2022年，星期五 四、离子选择性场效应晶体管型离子传感器