食品免疫学标记技术概述.pptxVIP

抗原抗体的标记及相关技术概述;免疫标记技术;标记免疫技术 创立时间 放射免疫测定 　 1960’ 酶免疫测定 　　 1970’ 荧光免疫测定 1980’－1990’ 化学发光免疫测定 1990’－ 金标记和固相膜 免疫测定 1990’－ ;最早建立的免疫标记技术－放射免疫技术;免疫标记技术按照标记物可分为：;免疫组化（组织切片） 免疫测定（液体） 固相膜免疫测定（以膜为载体）;荧光免疫标记概述;一 、概述;2.发射光谱:指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 3.激发光谱:指固定检测波长，用不同波长的激发光激发样品，记录相应的荧光发射强度。 ;3.荧光寿命:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同,镧系元素的鳌合物具有较常的荧光寿命。 铕 铽 铈 Eu3+ Tb3+ Ce3+;4.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬灭。 紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。;荧光物质;6.检测仪器;放射性核素：原子核能自发衰变、释放能量并伴 随射线发射的物质放射性核素衰变方式有α、β和γ3种， β和γ衰变及发射的射线可用于免疫标记技术。;; 胶体金（银）免疫标记;胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（gold solution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。 胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间。;酶免疫技术;一、基本原理;①辣根过氧化物酶（HRP） 常用底物： 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，终止液作用后为黄色,应避光，致癌性。最大吸收波长 492 nm。 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色，终止液作用后为黄色,无需避光，无致癌性，但水溶性差。最大吸收波长 450 nm。 ;② 碱性磷酸酶（AP） 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色，最大吸收波长405 nm。 * AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率低于HRP;价格高，应用不如HRP普及。;③β-半乳糖苷酶;３. ???标记抗体或抗原的的方法;;三、异相酶免疫测定 ;（一）酶联免疫吸附试验 ( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA);用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（游离与结合标记物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）;ELISA的反应系统 固相的支持物 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 待测标本 ELISA检测仪 ;（二）应用ELISA检测抗原的技术类型;1.双抗体夹心法(测抗原);双抗体夹心法的特点与应用条件 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 ;2. 双位点一步法 (测抗原);3. 竞争法(测抗原); 竞争法的特点： 用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。;（三）应用ELISA检测抗体的技术类型;1. 间接法(包被抗原检测抗体);2. 捕获法（反向间接法,测抗体的类和型）; 四、酶免疫测定技术特点和应用 ;①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性 ②酶促反应专一性，保证特异性 ③底物反应放大作用，提高敏感性 ④酶标试剂保存稳定 ⑤操作简便，安全易行 ; (二)酶免疫测定的应用;思考题