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结核分枝杆菌荧光定量检测试剂盒研发步骤 非竞争性内标法 模板的获得（TB标品和内标DNA） (1) 普通PCR反应 选用一种工作标准品为模板，根据巨细胞病毒荧光定量检测试剂盒说明书进行普通PCR反应，反应后溶液进行琼脂糖凝胶电泳，并对目的条带进行切胶回收。 (2) 连接 由于Taq酶的PCR反应产物末端带A，故直接以上述切胶回收的PCR片段为目的PCR片段，按pGMT克隆试剂盒进行10μl连接体系的配制，4℃过夜连接。 (3) 转化 10μl昨日过夜连接的体系转入50μl TP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃ 90s热激，冰浴2-3min，加入600μl LB培养基后37℃震荡培养90min。分别涂100μl于现倒的蓝白筛选平板，37℃过夜培养。 (4) 检测 挑取白色菌落接种于1-5ml LB培养基中，摇到一定浓度后，以菌液为模板用普通PCR进行验证。 (5) 测序 选择条带正确的菌液进行测序。 基因的查找和比对（TB标品和内标DNA） 从/网点的genbank中下载所需要的序列，与测序结果进行比对。由于不知道测序基因的具体名称，故需要进行大量的比对以找出其在genebank中的序列。 TB标品DNA序列： CACATCAGCCGCGTCCACGCCGCCAACTACGGTGTTTACGGTGCCCGCAAAGTGTGGCTAACCCTGAACCGTGAGGGCATCGAGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAACTCGGCCTGTCCGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGACCA TB内标DNA序列： CACATCAGCCGCGTCCACATCTGATCCGTAGCGACTACGGACGCGCGCCTACGCCCTTCTCAGTTAA 引物和探针的设计（TB标品和内标DNA） (1) 引物设计 引物序列： 上游引物TB-F： 5’ CACATCAGCCGCGTCCACG 3’ 19bp 下游引物TB-R： 5’ TGGTCCTGCGGGCTTTGC 3’ 18bp 内标引物： 上游引物TBN-F： 5’ ACATCAGCCGCGTCCAC 3’ 17bp 下游引物TBN-R： 5’ AACTGAGAAGGGCGTAGGC? 3’ 19bp (2) Taqman?探针设计 TB标品DNA探针（第一通道）： 5’ 端荧光报告集团FAM 3’ 端荧光淬灭基团TAMRA TB标品探针 FAM-AGGTGGCCAGATGCACCGTCGAACG-TAMRA TM=74 TB内标DNA探针（第二通道）： 5’ 端荧光报告集团HEX 3’ 端荧光淬灭基团BHQ1 TB内标探针 HEX-CTGATCCGTAGCGACTACGGACGCG-BHQ1 TM=73 实时荧光定量PCR实验体系的优化 (1) 引物退火温度 引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，进行温度梯度PCR，找到引物的最佳退火温度。 找到引物的最佳退火温度：58.8℃ (2) 引物浓度 引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。将引物的终浓度分别设置为几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上选取最佳的引物浓度。 (3) 探针浓度 ?由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2μM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。将探针的终浓度设置为200 nM左右的几个梯度，使用RT-PCR进行扩增，从扩增曲线质量上及电泳图谱选取最佳的引物浓度。如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。 (4) 镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。 (6) dNTPs浓度 将探针的终浓度设