海洋生物技术：海洋动物细胞培养.pptxVIP

海洋生物技术 第八章 细胞培养技术 1 第八章 细胞培养技术 工作任务 （一）海洋微藻的工业化培养 工作任务 （二）海洋动物细胞培养 工作任务 （二）海洋动物细胞培养技术 动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶酶原活性剂等。 动物细胞培养方法： 悬浮培养；固定化细胞培养 动物细胞发酵工艺条件的控制 培养细胞的生长和增殖过程 幼龄动物 取动物器官 和组织 剪碎组织 胰蛋白酶处理 细胞培养 单个细胞 细胞 悬液 10代细胞 50代细胞 无限传代 原代培养 传代培养 如何界定原代培养和传代培养? 多数组织细胞固定在表面生长和分裂。 随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 遗传物质改变 遗传物质未改变 有关概念 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 指数生长期 潜伏期 停滞期 细胞计数及活力测定 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数，结果以每毫升细胞数表示。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 细胞计数原理 细胞计数操作步骤 1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 细胞活力测定步骤 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 二 动物细胞大规模培养： 在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。 （一）动物细胞生物反应器的类型及 其基本结构 1、搅拌式生物反应器 2、气升式生物反应器 3、中空纤维式生物反应器 4、透析袋或膜式生物反应器 5、固定床或流化床式生物反应器 1、搅拌式生物反应器 机械搅拌式生物反应器 2、气升式生物反应器 气升式生物反应器 与搅拌式生物反应器相比，剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，利于设备的密封，降低了造价。高径比一般在10：1左右。 3、中空纤维式生物反应器 中空纤维反应器 由数百乃至数千根中空纤维集束组成的反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤维壁厚为50-100m，呈多孔性，内层为超滤膜，内腔直径为200m，两端用环氧树脂等材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。 不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测。 4、透析袋或膜式生物反应器 膜式生物反应器 在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，因此有些学者设计了透析袋或膜式反应器，它们可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。 5、固定床或流化床式生物反应器 结构较简单，装填的材料可以是一切对细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有实心载体和有孔载体两类。 (二)动物细胞生物反应器的检测控制系统 1、培养过程需检测的物化参数 直接在线检出 取样离线检测 检测后计算 2、主要参数的检测和控制方法 ①温度 ②pH a在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量 b当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 ③溶氧 ④搅拌 ⑤进出液流量 思考： 2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物