染色体显微操作技术.pptVIP

物理图谱：描绘DNA上可以识别的标记的位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位，即物理距离），这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，分子标记及功能基因等。 构建作图文库→→建立克隆重叠群→→重叠群长度确定→→作图片段锚定→→整合图谱 第31页，共61页，编辑于2022年，星期一 染色体 DNA 作图文库 物理图谱 大分子DNA的提取 大片段DNA的克隆 物理作图 物理作图的主要环节 第32页，共61页，编辑于2022年，星期一 2.染色体显微切割的应用 2.1 感兴趣区域DNA克隆的构建 2.2 FISH探针的制备 为了检测以前不可辨认的肿瘤和遗传病的染色体异常，已普遍采用全染色体探针的荧光原位杂交技术。为满足日益增多的高质量染色体涂染探针的需求，染色体显微切割已用于许多FISH探针的制备，包括所有人类的染色体涂染探针、染色体臂涂染探针和区带特异性涂染探针。 2.3 染色体重排的检测 2.4 区域特异性cDNA的选择 第33页，共61页，编辑于2022年，星期一 染色体涂染技术 染色体涂染技术即将整条染色体、某条染 色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的 DNA制备成探针，然后用荧光原位杂交的方法， 将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微 镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分 析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的 一种新技术。 第34页，共61页，编辑于2022年，星期一 染色体涂染 第35页，共61页，编辑于2022年，星期一 第36页，共61页，编辑于2022年，星期一 第37页，共61页，编辑于2022年，星期一 染色体涂染技术 1.染色体DNA探针的制备 2.荧光原位杂交 ①流式细胞分类法； ②克隆基因库或体细胞杂交株； ③染色体显微切割和PCR扩增等途径。 第38页，共61页，编辑于2022年，星期一 1.染色体DNA探针的制备 ①流式细胞分类法（flow cytometry） 该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂 相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的 不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细 胞术将特定的染色体收集起来。 局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较 多,仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准 确地区分开来。 第39页，共61页，编辑于2022年，星期一 局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较 多，如牛 (2n=60) 和狗(2n=78)的所有常染色体及绵 羊(2n=54)和马(2n= 64)的大部分常染色体都是端位着 丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有 的染色体准确地区分开来。 第40页，共61页，编辑于2022年，星期一 1.染色体DNA探针的制备 ②克隆基因库或体细胞杂交株 通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交 细胞系制备某条染色体整个或部分DNA探针。该法特异 性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来， 但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制 。 ③染色体显微切割和PCR扩增 通过该方法制备的染色体DNA探针，相对而言， 具有直接、准确、 简便和应用范围广等优点。 第41页，共61页，编辑于2022年，星期一 2.荧光原位杂交（ fluorescent in situ hybridazation,FISH） 原位杂交是基于DNA分子复制原理而发展 起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、 荧光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针, 与组织切片或细胞内待测核酸 (RNA或DNA） 片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以 显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA 的存在及定位。 第42页，共61页，编辑于2022年，星期一 2.荧光原位杂交 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性 原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性 分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记 而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某 种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过 程连接上荧光染料。 第43页，共61页，编辑于2022年，星期一 基本原理： 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与 所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复 性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针 的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可 利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫 化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、 定量或相对定位分析。 第44页，共61页，编辑于2022年