白蛋白对脂多糖诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用及机制.docVIP

白蛋白对脂多糖诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用及机制 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：白蛋白对脂多糖诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用及机制 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 7 文2：人外周血树突状细胞的诱导培养及其表面标记的鉴定医学论文 8 1材料和方法 8 1．1材料 8 1．2方法 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 白蛋白对脂多糖诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用及机制 文1：白蛋白对脂多糖诱导人外周血中性粒细胞胞外诱捕网生成的抑制作用及机制 中性粒细胞是宿主应对外来入侵的重要防线[1]。中性粒细胞可通过吞噬、脱颗粒以及产生大量活性氧来清除病原体[2]。近来发现，中性粒细胞可通过释放自身核酸为骨架并锚定大量抗菌蛋白至胞外生成胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs），并介导机体对病原体的捕获和清除作用[3，4，5]。然而过度的NETs生成参与了多种自身免疫疾病的病理过程[6，7]。脂多糖/内毒素（lipopolysaccharide/endotoxin，LPS）是导致脓毒症发生的主要病原体[8]。研究表明脓毒症时LPS可诱导中性粒细胞产生NETs[9]。NETs多种组分会诱导血管内凝血反应，最终导致弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC)[10，11，12]。因此，研究脓毒症时NETs过度生成的发生机制对寻找有效的干预措施具有重要意义。 白蛋白是血清中的主要蛋白成分，在维持机体营养和渗透压过程中具有重要作用[13]。最新研究表明，白蛋白不足或活性缺失可能与NETs的生成密切相关[14]。但白蛋白对于LPS诱导NETs释放的调控作用和可能机制尚不清楚。对其深入研究，有助于阐明脓毒症时NETs生成以及凝血功能障碍的具体机制和为临床治疗脓毒症提供新的思路。因此，本研究首先在明确白蛋白抑制LPS诱导NETs生成的基础上，进一步研究钙离子和自噬在介导白蛋白抑制LPS诱导NETs的关系，最终阐明白蛋白抑制LPS诱导NETs生成的分子机制。 1、材料与方法 实验材料 人中性粒细胞分离试剂盒购于天津灏洋公司。Sytox Green、Fluo-4 AM购于Invitrogen公司；LPS、EGTA、3-MA和雷帕霉素（Rapamycin）购于Sigma公司；胎牛血清购于Serabest公司；人、牛血清白蛋白均购于索莱宝生物科技有限公司，人血清白蛋白纯度99%(agarose gel electrophoresis)，牛血清白蛋白纯度97%；鼠、马血清白蛋白均购于EquitechBio公司，纯度均大于96%；抗LC3B、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、弹性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3，Cit-H3）抗体购于Abcam公司；Cy3标记的荧光二抗购于CellSignaling Technology）公司；A23187购于Selleck公司；DAPI购于碧云天公司。 人外周血中性粒细胞分离与培养 取4 ml中性粒细胞分离液于玻璃离心管，每管缓慢加入柠檬酸盐抗凝的健康志愿者外周静脉血4 ml，20℃，800 g离心20 min。离心后吸取下层中性粒细胞层至另一无菌离心管中，10 ml清洗液，充分混匀，20℃，360 g离心5 min，弃上清，加入5 ml红细胞裂解液，混匀后裂解5 min。加入10 ml清洗液，20℃，220 g离心5 min。弃上清，加DMEM培养基重悬细胞，37℃，5%CO2培养待用。 NETs检测 用培养基调整中性粒细胞数为1×106/ml接种于玻璃培养皿中。加入不同质量浓度的LPS或其余试剂作用一定时间。加入Sytox Green(1μmol/L）对释放出胞外的NETs核酸骨架进行染色，使用共聚焦显微镜在激发光488 nm，发射光520 nm的条件下随机采集荧光图片，使用ZEN 2012软件对所得图像进行定性分析。同时将中性粒细胞（1×106/ml）接种于24孔板中。加入LPS或其余试剂处理后，加入核酸酶S7作用10 min，吸取上清，300 g离心10 min。取200μl上清，加入Sytox Green(1μmol/L）染色，使用多功能读数仪器检测荧光强度（n=3） 免疫荧光检测 使用640 ng/ml LPS刺激含1%FBS培养基培养的中性粒细胞3 h，弃上清，加入4%多聚甲醛固定20