宿主细胞和小鼠体内在miR125b5p促进下分枝杆菌的存活观察研究.doc

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宿主细胞和小鼠体内在miR125b5p促进下分枝杆菌的存活观察研究 目录 TOC \o "1-9" \h \z \u 目录 1 正文 1 文1:宿主细胞和小鼠体内在miR125b5p促进下分枝杆菌的存活观察研究 1 1、材料和方法 2 2、结果 4 3、讨论 7 文2:神经营养素┐3重组腺病毒促进脊髓背根神经节的存活医学论文 8 0 引言 9 1 材料和方法 9 2 ,饱和湿度培养. 10 2 结果 11 3 讨论 12 参考文摘引言: 13 原创性声明(模板) 14 文章致谢(模板) 15 正文 宿主细胞和小鼠体内在miR125b5p促进下分枝杆菌的存活观察研究 文1:宿主细胞和小鼠体内在miR125b5p促进下分枝杆菌的存活观察研究 结核病(Tuberculosis, TB)的病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)能在宿主细胞内寄生、繁殖。Mtb侵入机体后可被巨噬细胞表面的受体识别,通过胞吞作用进入巨噬细胞[1]。毒性较强的Mtb不但能抑制吞噬体和溶酶体的融合,阻止吞噬细胞对其的杀伤,而且能够调节巨噬细胞的分化和成熟,从而进行免疫逃逸[2]。γ干扰素活化的巨噬细胞可促进吞噬体与溶酶体融合来清除细胞,因此,细胞免疫在调控Mtb感染过程中发挥重要作用。探究Mtb与宿主细胞的关系,对于深入阐明Mtb的致病机制以及宿主的抗结核免疫具有重要意义。 microRNA(简称miRNA)是一种约19~22 nt长的内源性非编码RNA,通过与靶基因的调控区域结合,在转录后水平降解mRNA或抑制靶基因的翻译,从而调控基因的表达[3]。Mtb感染能引起宿主细胞中miRNA表达量发生显著变化。以往的研究表明,命名为miR-125b-5p的miRNA在结核病人体内含量显著升高[4,5],但其具体作用机制未知。本研究通过观察miR-125b-5p对分枝杆菌在宿主细胞及小鼠体内生长情况的影响,探讨其与结核感染的关系,以期证明miR-125b-5p在抗结核免疫过程中所发挥的作用。 1、材料和方法 材料 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, MS)和牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine, BCG)由本实验室保存。人肺上皮细胞A549、人巨噬细胞THP-1及鼠巨噬细胞源自中国科学院生化细胞研究所细胞库。 C57BL/6小鼠,SPF级,7~8周龄,雌性,共12只,购自上海斯莱克实验动物有限公司。 7H9液体培养基和10%OADC增菌液购自BD公司,7H10固体培养基购自BD公司,1640培养基加10%胎牛血清(fatalbovine serum,FBS)购自GIBCO公司。 miR-125b-5p模拟物(miR-125b-5p-mi)、miR-125b-5p抑制剂(miR-125b-5p-in)及其miRNA对照(mi-con、in-con)均购自天根生化科技有限公司,Trizol购自Qiagen公司,miRcutemiRNA Fit-Strand cDNA Synthesis试剂盒和miRcute miRNA q-PCR Detection(SYbr Green)试剂盒购自天根生化科技有限公司。表达miR-125b-5p抑制剂的慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司。 miR-125b-5p荧光定量聚合酶链反应引物(5′-UCA CCGGGUGUAAAUCAGCUU-3′)和U6引物(5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′)购自天根生化科技有限公司。 方法 分枝杆菌培养采用7H9液体培养基和10%OADC增菌液,在37℃恒温培养箱中进行。用7H10固体培养基和10%OADC培养3~4周,然后计算菌落数目。 所有细胞都采用1640培养基加10% FBS,于5% CO2和37℃条件下培养。 miRNA转染 按照转染试剂Lipo2000的说明书,将终浓度为50 nmol/L的miR-125b-5p-mi、miR-125b-5p-in及其对照mi-con、in-con与细胞孵育。在孵育后的不同时间点收集细胞,进行实验。 在被细菌感染前,用佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)以50 ng/ml的浓度诱导THP-1细胞。分别用分枝杆菌以MOI=10∶1(细菌∶细胞)的比例感染诱导后的THP-1细胞、A549或细胞。感染4 h后,洗掉未被细胞吞噬的细菌。根据实验目的在不同的时间点取样,用于提取RNA或microRNA,或者用于菌落计数。 用Trizol裂解细胞,抽提总RNA,用mi

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