实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板).pptVIP

双标准曲线法 2 -△△Ct法 相对定量分析方法 相对定量分析实例分析 利用TaqMan法研究ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 构建标准曲线 双重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（基因组） 双标准曲线法 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 – FAM detection for ERBB2 样品扩增：正常vs肿瘤 PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH 肿瘤 肿瘤 正常 正常 双标准曲线法——实验结果 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma 28.40 27.36 28.46 27.12 28.43± 0.04 26.24 ± 0.17 ERBB2表达 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma 23.27 22.81 23.41 22.86 28.34± 0.10 26.83 ± 0.03 GAPDH表达 Healthy RNA Tumor RNA GAPDH ERBB2 1095 1052 2130 2492 95500 85730 136000 130800 Copies ng/ μl Total RNA ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019 Healthy RNA Tumor RNA 0.011 0.018 0.018/ 0.011=1.63 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression 双标准曲线法——结果分析 ΔΔC(t)=4.41-5.18=-0.77±0.18 2-ΔΔc(t) =1.51-1.93 结果与双标准曲线法相近 Healthy RNA BBER2 GAPDH ΔC(t) 28.40 23.27 5.31 28.46 23.41 5.05 28.43± 0.04 28.34± 0.10 5.18±0.18 Carcinoma RNA BBER2 GAPDH ΔC(t) 27.36 22.81 4.55 27.12 22.86 4.26 26.24 ± 0.17 26.83 ± 0.03 4.41 ±0.21 2 法——实验结果 －△△Ct 样品制备 环境要求 定量体系配备 数据分析 RT 上机 浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项 无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具 纯度高、完整性好的RNA 分光光度计检测 电泳检测 cDNA的合成 反应体系优化 试剂选择 样品制备 定量体系配备 数据分析 上机 AMV M-MLV Quant 下游反应数确定反转录体积 引物的选择 高效、全长的cDNA SYBR法实验流程及注意事项 PMT2-VIC detection- GAPDH 重复反应孔 –——建议每个样本设置三个或三个以上重复孔，以确保统计结果的可信度。 平滑曲线，重复性好，灵敏度高 委托公司标记，价格较高 18-30 cycles 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 Healthy RNA E=10（-1/slope）-1 扩增长度：100－200bp 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 双标准曲线法——结果分析 Taqman探针法——原理 均一的反应液和模板混合物 qPCR 常用实验方法 病原体检测，疾病耐药基因研究,药物疗效考核 log Xn=log [X0 (1+Ex)n] G/C 含量: 40-60% Bioer－Linegene series cDNA合成 (两步法 qRT-PCR) 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 双标准曲线法——实验结果 输入要查找的蛋白或是基因名称 cDNA合成 (两步法 qRT-PCR) qPCR关键 cDNA影响qPCR敏感度 全长cDNA合成增加qPCR成功率 引物 Oligo(dT): 只识别mRNA，合成cDNA序列靠近3 ’ 随机引物: