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探究鸭圆环病毒Cap蛋白的表达及活性鉴定 目录 TOC \o "1-9" \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探究鸭圆环病毒Cap蛋白的表达及活性鉴定 1 1、材料与方法 2 2、结果与分析 4 3、讨论 6 文2：蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆表达及活性鉴定 7 1 材料和方法 8 2 结 果 11 3 讨 论 13 参考文摘引言： 15 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 16 正文 探究鸭圆环病毒Cap蛋白的表达及活性鉴定 文1：探究鸭圆环病毒Cap蛋白的表达及活性鉴定 鸭圆环病毒[1]属于圆环病毒科，是无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股环状DNA，主要侵害宿主的免疫系统，造成宿主免疫功能低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经济损失[2，3]。目前，动物圆环病毒中，鸡传染性贫血病病毒和猪圆环病毒的体外增殖[4，5]研究比较深入，而DuCV由于没有体外增殖的方法，所以研究进展缓慢。杆状病毒表达系统具备完整的翻译后修饰系统，明显优于细菌和酵母，且易于操作及大规模生产等[6]。本研究拟利用杆状病毒表达系统表达鸭圆环病毒的Cap蛋白，为进一步研究Cap蛋白的功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定基础。 1、材料与方法 材料 、细胞和载体: 感受态细胞JM109购于宝生物工程(大连)有限公司，昆虫杆状病毒线性杆粒、p1064转移载体和鸭圆环全基因组PMD18-T-HZ1701质粒由山东诸子生物科技有限公司实验室提供，Sf9悬浮昆虫细胞由上海倍谙基生物有限公司提供。 PrimeSTARDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarkerDL2000、DL5000、DL10000均购自宝生物工程(大连)有限公司，氨苄青霉素、卡那霉素、HRP标间羊抗兔IgG抗体、蛋白Marker购自生工生物工程(上海)股份有限公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒、HRP-DAB显色试剂盒、预染蛋白Marker购自北京索莱宝科技有限公司，转染试剂IectGeneJuice购自Novagen公司，其他化学试剂皆为国产分析纯。 根据本实验室扩增获得鸭圆环病毒HZ1701株的全基因组核苷酸序列，设计1对引物:F，5′-CAGTCATGAGACGCAGCACCTATCGG-3′;R，5′-CCACTCGAGGAACCCGGTGAACTGTC-3′。该引物用于扩增DuCVCap基因完整的ORF，分别含BspHI、XhoI酶切位点，扩增片段长785bp。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 方法 以测序正确的含HZ1701株全基因重组质粒DNA作为模板，按50μL常规反应体系进行PCR扩增。扩增条件:94℃30s;98℃10s，℃5s，72℃1min，共35个循环;最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段。 将回收目的片段用BspHⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切，转移载体P1064用NcoⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切，然后回收酶切产物，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。将连接产物转化JM109感受态，涂于含Amp+的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑取阳性菌落扩增提取质粒后，进行XhoⅠ酶切鉴定、HindⅢ(选用Cap基因上的1个酶切位点)和XhoⅠ双酶切鉴定，得到重组质粒p-Cap，同时送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 参照Novagen公司转染试剂IectGeneJuice说明书，将重组转移载体p-Cap和杆状病毒线性杆粒共同转染Sf9昆虫细胞，同时设立正常Sf9细胞为对照。144h后收集细胞上清为P0代病毒液，100倍稀释后接种(密度为×106个/mLSf9悬浮细胞)，72、96、120h收获病毒样品，离心去除细胞碎片获得不同收获时间P1代病毒液。将P1代病毒进行10倍系列稀释，涡旋混匀，稀释为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共6个稀释度，接种Sf9细胞，培养120h后观察不同稀释度每孔荧光情况，有荧光出现的判为感染，根据Reed-Muench法计算重组病毒效价(TCID50)，确定病毒最佳收获时间。 重组杆状病毒qBac-P-Cap按3MOI接种3×106个/mLSf9悬浮细胞，同时设立未感染病毒正常Sf9细胞为对照，27℃培养箱培养，在72、96、120、144h后收集样品。用超声波裂解仪破碎后，3000min离心10min，收集细胞裂解上清，加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸裂解15min，进行SDS检测蛋白表达情况。剩余细胞裂解上清按镍柱说明书进行蛋白纯化，收集纯化Cap蛋白样品按BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。 -blotting检测表达蛋白免疫原性: 将裂解上清处理样品用1