章植物原生质体培养与体细胞杂交演示文稿.pptVIP

3. 植物体细胞杂交技术 植物体细胞杂交技术包括以下三个环节： ? 诱导原生质体融合； ? 选择融合体或杂种细胞； ? 杂种细胞的培养与鉴定。 第三十页，共五十一页。 （1）诱导原生质体融合 诱导原生质体融合是体细胞杂交的基本技术环节，常用的方法有化学方法和电融合方法。 1）化学方法： 化学方法最早是用硝酸钙溶液作融合剂，但由于它本身对细胞有毒，且诱导融合的频率不高。目前最常用的化学融合剂是聚乙二醇（PEG）。 第三十一页，共五十一页。 PEG毒性低，且没有种、属、科间的特异性，只要掌握好试剂的分子量、浓度、处理时间和操作技术，可得到较高的诱导融合率（一般在10%以上），且诱导的融合体在合适的培养条件下可再生植株。其缺点是易形成多融合体。 在PEG溶液中加入融合促进剂如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亚砜、链霉蛋白酶、精胺、亚精胺等，都能明显提高融合频率。 第三十二页，共五十一页。 PEG溶液加到混合原生质体悬液中，引起原生质体凝集，但PEG诱导融合的机理目前还不清楚，有研究发现，将商品PEG纯化后就完全失去了诱导融合的能力，但并不影响原生质体的凝集。对纯化除去的杂质经鉴定是一些抗氧化剂，如?-生育酚（Ve）和其它酚类衍生物。如把纯化的PEG与低分子量的脂肪酸结合应用，融合频率比商品PEG高15~20倍。 第三十三页，共五十一页。 常用的 PEG 和高 pH高Ca 相结合诱导融合的具体操作程序： ? 混合双亲原生质体悬液，吸一小滴悬液于小培养皿中，5~15min后原生质体沉到底面形成薄层； ? 每一小滴悬液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的组成：2难度ml 溶液（内含0.1 mol 葡萄糖、10.5 mmol CaCI2、0.7 mol KH2PO4，KOH调节pH到 5.5）加1g PEG-1560（或4000、6000，其它浓度） ? 25 0C保温15~45min 第三十四页，共五十一页。 ? 用0.5 ml 高 pH 高 Ca 溶液稀释（50mmolCaCl2、0.3 mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸馏水，NaOH调pH到10.5）. ? 15min后加另一滴（约 0.5ml）高 pH高Ca溶液； ? 15min后用1~2ml原生质体培养基稀释； ? 用总量为20ml培养基洗涤5次； ? 在0.5ml左右原生质体培养基中培养。 第三十五页，共五十一页。 该技术从建立（1979）以来发展很快。电融合需要有特制的融合仪和融合板，原生质体放在板上的两电极之间。先给两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向呈串珠状排列，接着给以瞬间高强度电脉冲，使原生质体膜局部损伤而导致融合。 处理时原生质体的适宜密度、CaCI2的浓度、 变电流的强度、电脉冲的大小、脉冲期宽度与间隔都影响融合的频率。 2）电融合法： 第三十六页，共五十一页。 章植物原生质体培养与体细胞杂交演示文稿 第一页，共五十一页。 （优选）第九章植物原生质体培养与体细胞杂交 第二页，共五十一页。 二、原生质体的分离 1. 材料的选取 根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但要获得高质量的原生质体，应选用生长旺盛、生命力强的组织。材料的生理状态是原生质体质量的决定因素之一，实践证明 水肥条件、生长季节、植物年龄、光照等都显著影响原生质体的获得和活力。 用悬浮细胞为材料时应每隔3-5天继代一次，使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天分离原生质体。用叶片作材料时，一般选用刚展开的幼嫩叶片。此外植物生长的湿度、温度等条件对原生质体的分离效果也的明显的影响。如生长在相对湿度为70%，温度为26度的芸苔叶片只能得到少量不能持续分裂的原生质体，而在相对湿度为40-45%，温度为19-21 度条件下生长的叶片可得到理想的原生质体。 第三页，共五十一页。 植物细胞壁是由纤维素（25%~50%）、半纤维素（50%左右）、果胶质（5%）组成。因此常用三种相应的酶来降解细胞壁。一般认为纤维素酶和果胶酶是必需的，有些材料要加半纤维素酶。